体外三维肝细胞模型在药物肝毒性评价中的应用

何原子，张雷，吴春勇*，张峻颖

(1.中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009；2.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 211198；3.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；4.中国药科大学中药制剂教研室，江苏 南京 211198)

肝脏是负责异源生物代谢的主要器官，也是药物及其代谢物发生不良反应的重要靶器官。据统计，在进入Ⅲ期临床试验阶段的新药中，20%以上的候选药物出现肝毒性[1-2]，每个新化学实体的经济损失高达26亿美元[3]。因此，开发可以真实预测药物诱导肝毒性(drug-induced hepatotoxicity)的肝脏模型，并用于临床前肝毒性药物筛选，对于新药研发至关重要。尽管动物模型可以在一定程度上反映药物在复杂机体内的处置情况，但实验成本高、周期长以及种属差异等缺点限制了此类模型在肝毒性预测方面的大规模应用。

人原代肝细胞(primary human hepatocytes，PHH)的平面培养模型是目前评估药物代谢和毒性的金标准模型[4]，但在2D培养过程中，原代肝细胞迅速去分化并丧失肝脏特异性功能[5]，无法有效监测长期或重复给药时的肝毒性反应[6]。

为了解决上述难题，3D细胞培养技术被用于体外肝细胞模型的构建。与传统的2D细胞模型相比，3D肝细胞模型可以在体外模拟细胞-细胞、细胞-细胞外基质(extracellular cell matrix，ECM)的相互作用，进而重现肝组织的特异性功能，为体外预测药物毒性提供了更高的生理相关性[7]。一个理想的体外3D肝细胞模型应当满足以下要求[8-11]：①在Ⅰ、Ⅱ型代谢酶、转运体以及肝脏特异性蛋白上与体内肝细胞具有一致的表型；②可在较长的时间内稳定维持肝细胞活力以及肝脏特异性功能；③对药物的毒性反应灵敏，且具有分辨急性或长期肝毒性药物的能力；④可重现体内形态学特征与生理参数，如胆管的生成、与非实质细胞的共培养以及含氧水平等；⑤适用于高通量毒性药物筛选。与3D肝细胞模型相关的评价指标见表1。

研究人员已经开发出许多建立3D肝细胞模型的方法，本综述将重点讨论三明治模型、球样体模型、3D打印模型以及微流控模型在肝毒性评价的应用以及各自的特点(见图1)，以期为3D体外肝毒性模型的下一步发展提供参考。

A.灌注培养三明治模型的F-actin染色图[38](Scale bar=20 μm)；B.倒胶体晶体支架中HepG2球样体的荧光染色图[56](Scale bar=200 μm)；C.3D生物打印构建的微型肝组织示意图以及HE染色图[69](Scale bar=25 μm)；D.微流控芯片制造人造肝组织的示意图以及实物图[73]

1 三明治模型

由于2D培养无法复制细胞与细胞外基质构成的天然微环境，PHH 在24 h内迅速去分化并失去部分肝功能[22]。为了模拟肝细胞在生理条件下的生长情况，Dunn等[23]将大鼠的肝细胞置于两层胶原蛋白凝胶之间培养，形成“三明治”结构，该模型可在42 d内维持大鼠肝细胞的正常形态与白蛋白分泌功能。三明治模型的夹心结构增强了肝细胞之间的相互作用，可为胆小管的形成提供必要的细胞极性[24]，通过对胆汁酸排泄以及药物肝胆处置过程的监测实现体外肝毒性评价[25-26]。譬如在三明治培养的PHH中，2型糖尿病治疗药物曲格列酮[27]和抗抑郁药奈法唑酮[28]都会抑制胆汁酸转运体(BSEP)，从而引起胆汁淤积。Lee等[29]等利用大鼠原代肝细胞的三明治模型，探讨了地塞米松缓解抗肿瘤药物曲贝替定诱导肝毒性的作用机制，发现地塞米松的干预下，多药耐药相关蛋白2(MRP2)介导的胆汁排泄以及CYP3A1/2介导的代谢增加，从而使曲贝替定的肝脏毒性降低了2～3倍。为改善三明治模型中氧气以及营养物质的输送，Zhang等[30]将灌注培养系统引入三明治模型，此模型在维持细胞形态、尿素生成以及代谢酶活性的同时，表现出比静态培养的三明治模型更高的药物敏感性(图1-A)。然而，与体内肝细胞相比，三明治模型仍然存在自身的局限性，如三明治模型中肝细胞的表型以及胆小管的生成对于ECM的依赖程度较高，ECM性质的变化可能会影响模型预测的准确性[31]，长期实验过程中胆小管的泄漏和损坏也限制了三明治模型的发展[32]。

2 球样体模型

与三明治培养相比，球样体模型表现出更为紧密的细胞间相互作用[33]。肝细胞在低黏附培养板、悬滴培养或旋转生物反应器中培养时，均可通过自组装形成球样体[34-36]。这类无须细胞黏附底物、通过悬浮细胞自发聚集成球的模型也被称为无支架模型，其中简单易行的低黏附培养板最为常用。低黏附培养形成的原代肝细胞和HepaRG球样体模型在细胞活力、代谢酶功能(CYP1A2、CYP2C8、CYP3A4)和尿素分泌方面的表现较三明治模型更优[37]，在肝毒性药物如抗精神病药氯丙嗪、非甾体抗炎药对乙酰氨基酚、降压药波生坦以及帕金森治疗药物托卡朋等的重复暴露实验中，表现出了更高的敏感性和预测能力[38-40]。PHH球样体更是在蛋白质组[12]、转录组[41]方面表现出与体内肝脏的高度相似性，并且可以在三周内稳定保持与体内一致的代谢组特征[42]。

与无支架模型相比，有支架模型的优势在于为形成球样体的细胞提供了有利于增殖和迁移的环境[43]。在以半乳糖基修饰的纤维素、钙-海藻酸盐等材料为代表的细胞支架中，肝细胞球样体在白蛋白和尿素合成、药物敏感性、以及Ⅰ、Ⅱ型代谢酶的表达上具有优势[44-46]。然而，球样体模型的主要缺点在于难以形成均一的尺寸，这种差异可能导致球体内部的细胞间相互作用不同，从而引起细胞活力水平的变化。譬如，较小的球样体无法提供与体内相似的生理特性，而直径太大的球样体中心容易出现缺氧坏死[47]。

为了更好地控制球样体的直径，倒胶体晶体支架(inverted colloid crystal，ICC)应运而生，如图1-B所示，HepG2细胞在ICC支架中形成大小均一的球样体[48]。这是一种高度均匀的体系，其中的孔状结构可以促进细胞之间的相互连接，材料具有良好的传质性，可以保持营养成分的均匀渗透[48-50]。Ng等[51]将原代人胎儿肝细胞培养于铺被胶原蛋白Ⅰ的ICC支架中，该模型在体外可维持长达5个月的肝脏特异性功能，代谢酶CYP3A4、2D6以及2C19的活性在培养7周内维持上升趋势，可在体外预测氟尿苷的肝毒性作用机制。但人胎儿肝细胞具有来源稀缺以及伦理争议等缺点，无法广泛用于体外肝毒性模型的建立[52]。于是Ng团队改用由诱导型多功能干细胞(iPSC)衍生得到的肝祖细胞(IH)，在Matrigel修饰的ICC支架中构建了肝脏类器官，模型表现出与体内相似的形态学以及转录组学特征，在蛋白质分泌，药物代谢方面等方面的表现更接近成年人的肝组织[53]，但ICC支架培养需要额外的ECM涂层(胶原蛋白Ⅰ以及Matrigel)，步骤烦琐，涂层的厚度也会影响模型的可重复性。

3 3D生物打印模型

3D生物打印是将含细胞的生物墨水以自动化的方式逐层打印成型，通过改变生物墨水的组成以及目标结构的不同而实现对体外器官模型的灵活构建[54]。常用于构建肝细胞模型的生物墨水有甲基丙烯化明胶(GelMA)[55]、胶原蛋白[56]、纤维蛋白[57]和海藻酸钠[58]等。3D生物打印技术在肝细胞模型的构建上仍处于起步阶段，与其他模型相比，3D生物打印构建的肝脏模型适用于多细胞培养，具有与体内组织水平相当的细胞密度，并可在较长的培养周期内实现肝脏特异性功能的持续表达[59]。Faulkner等[60]将人类诱导多能干细胞(hiPSC)和人类胚胎干细胞(hESC)打印到藻酸盐水凝胶中，诱导形成肝样细胞(HLC)，模型中细胞核因子4α(HNF4α)和白蛋白可稳定表达超过21 d。Nguyen等[61]进一步构建了包括肝实质细胞PHH、非实质细胞肝星状细胞和内皮细胞HUVEC在内的3D肝脏微组织(图1-C)，具有与体内肝脏相似的特性(如脂质与糖原的储存以及实质与非实质细胞之间的分区)，可在4周内维持肝细胞活力、白蛋白和CYP3A4的表达。基于组织工程学上的优势，3D生物打印构建的肝细胞模型在药物肝毒性评价上也具有良好的前景。Richard等通过优化胶原蛋白I-透明质酸这一混合生物墨水的比例，进行了原代肝细胞和肝星状细胞共培养的3D肝组织构建，并将对乙酰氨基酚(APAP)作为验证模型毒性预测能力的指标，结果表明该组织表现出了与体内相似的药物反应[62]。Massa等[63]使用牺牲材料搭建微血管通道，将HUVEC引入封装于GelMA中的HepG2/C3A球样体中，构建了血管化的肝脏模型，APAP诱导毒性实验结果表明，血管的存在使得APAP对肝球样体的毒性作用得到了缓解。

4 微流控模型

利用微流控技术制造的动态肝脏体外系统，也被称为“芯片上的肝脏”[64-65]，已被用于药物筛选、毒性测试、新陈代谢预测、肝病模型建立以及多器官相互作用研究等领域[64]。微流控技术也适用于多细胞共培养模式。Deng等[65]将HepG2、人肝星形细胞LX-2、人脐静脉细胞融合细胞EA.hy926和人组织细胞淋巴瘤细胞U937按生理状态排列，构建了人造肝芯片，并分别在其上层和下层构建了供血液以及胆汁通过的人造管道(图1-D)，与单层静态培养模型相比，此模型大幅提高了肝细胞的合成和分泌功能，包括CYP1A1、CYP1A2和UGT酶的活性，以及对药物代谢毒性的敏感性。Kalchman等[66]制造了由HepG2和HUVEC细胞共培养组成的肝小叶阵列，通过操作介质电泳，使得微流体室中随机分布的细胞重新排布成类似于肝小叶的状态，并由此将HepG2细胞中CYP450酶的活性提高80%。除了多细胞共培养外，与其他模型的联用可以进一步优化体外肝脏微流控模型。Bhise等[67]采用3D点阵列打印肝球样体模型，培养时引入微流控芯片的动态灌注功能，不仅可维持白蛋白、ZO-1、MRP2等肝功能指标的长期表达，并可发现APAP引起的长期毒性反应。微流控系统结合多细胞共培养以及多模型联用技术，能够获得比静态系统更好的预测值和更高的代谢活性，并有望实现个性化药物筛选[68]。

5 总结与展望

相对于传统的2D肝细胞模型，3D模型在细胞间相互作用、肝脏表型的可持续性和体外肝功能重现等方面更有优势，可以为药物研究和疾病治疗提供更加可靠的平台。但由于器官结构和功能的复杂性，目前的3D肝模型仍与体内器官存在较大的差距，细胞共培养以及多模型联用将成为之后体外肝脏模型的主流[9]。通过将多学科融合的大数据以及人工智能等前沿信息技术用于新型材料的发现以及培养技术的优化，未来的3D肝细胞模型定会在毒效评价、新药发现等方面展现出更大的潜力。