王 丽,刘光辉,林 韵,张洪生,高爱明,孟 春,赵 利,周子鑫
(1.福建中医药大学附属人民医院,福建 福州 350004;2.福州大学生物科学与工程学院,福建 福州 350108)
糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为危害人类健康最大的疾病之一,中国是目前全球糖尿病患者人数最多的国家,2017 年流行病学调查显示中国糖尿病总患病率高达11.2%[1]。 DM 并发症众多,长期高血糖会导致患者出现不同程度的学习和记忆能力下降,严重者会出现认知功能障碍甚至痴呆,临床称此为糖尿病脑病(diabeticencephalopathy,DE),发病原因可能与长期高血糖导致脑微血管病变有关[2],具体机制尚不十分明确。
有研究表明:DM 代谢产物——晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)能够激活TGF-β1/Smads 信号通路,诱导脑微血管相关结构蛋白表达异常,损伤血脑屏障,引起脑微血管病变[3]。 益景汤是福建中医药大学附属人民医院治疗DM 微血管病变的有效经验方, 临床应用多年。本团队临床研究表明益景汤能够改善DM 患者眼部微血管循环[4-6],降低糖尿病心肌病的血清学指标,对糖尿病心肌病有较好疗效[7],可有效改善早期DM 肾病患者症状[8]。 动物实验表明益景汤能够改善DM 大 鼠 眼 部[9-11]、心 脏[12]、肾 脏[13]的 血 流 动 力学,保护相应的器官功能,但在治疗脑微血管病变方面尚无相应研究。 本研究拟在前期研究基础上,采用DM 大鼠模型,基于TGF-β1/Smads 信号通路,研究益景汤对早期DM 脑微血管病变的影响。
1.1 实验动物 雄性健康清洁级SD 大鼠,鼠龄5~6 周,体质量(200±20)g,购买自福州诺顿斯生物科技有限公司,合格证号:20170012009954,饲养于福建中医药大学实验动物中心,许可证号:SYXK(闽)2020-0002,饲养环境温度21~25 ℃,相对湿度为50%~55%。 普通颗粒饲料喂养,自由饮水,12 h/12 h 明暗交替光照。 实验动物的处理按国家科学技术委员会1988 年颁布的《实验动物管理条例》执行。
1.2 实验试剂 链脲佐菌素(美国Sigma-Aldrich 公司);一抗(英国Abcam 公司),包括:晚期糖基化终产物特异性受体(RAGE)、转化生长因子β1(TGFβ1)、同源物4 重组蛋白(Smad4)、纤维连接蛋白(fibronectin)、紧密连接蛋白5(claudin-5)、Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ);二抗(福州迈新生物技术开发有限公司);WB 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);柠檬酸盐(北京中杉金桥生物技术有限公司);10%中性福尔马林固定液(北京百奥莱博科技有限公司);血糖试纸(拜耳医药保健有限公司)。
1.3 实验药物 益景汤(福建省名老中医金威尔有效经验方),组成:生黄芪15 g,山药15 g,苍术9 g,桃仁5 g,红花5 g,当归9 g,川芎6 g,赤芍10 g,茯苓15 g,生地黄15 g,玄参15 g。 每剂水煎至50 mL(药物浓度约2.38 g/mL),灭菌玻璃瓶灌装,密封避光备用。
2.1 造模及分组 将健康雄性清洁级SD 大鼠30 只随机分为正常组、模型组、益景汤组,每组10 只。 正常组常规喂养,其余2 组进行DM 模型制备[11]。适应性喂养7 d,禁食12 h 后,将链脲佐菌素用0.1 mmol/L、pH 值4.5 的无菌柠檬酸缓冲液溶解,配置成1%溶液后,按70 mg/kg 剂量进行一次性腹腔注射。 72 h 后取大鼠尾血检测血糖,血糖浓度≥16.7 mol/L 即视为DM 模型制备成功。
2.2 给药 正常组常规喂养;益景汤组予益景汤水煎液灌胃,按10.71 g/(kg·d)计算,取药1.35 mL,加蒸馏水稀释至3 mL,一次性灌胃,每日1 次;模型组给予生理盐水3 mL/d 一次性灌胃,每日1 次。 2 组分别干预16 周。
2.3 取材及制片 各组大鼠干预16 周后,采用一氧化二氮吸入麻醉后,记录体质量;脱椎处死3 组大鼠,剪开颅骨,剥离出完整脑组织,记录脑实质重量,并测量体积。 沿矢状面对剖,取一半放入液氮保存,另一半沿矢状面2 mm 厚度切片,放入包埋盒,投入10%中性福尔马林固定24 h 后行病理切片制备。
2.4 Western blot 检测 取出3 组液氮保存的脑组织,匀浆、裂解后置入离心管中,4 ℃条件下离心5 min,取上清液进行蛋白含量测定;SDS-PAGE 凝胶电泳;将3 组蛋白转移至硝酸纤维素薄膜,5%牛奶37 ℃封闭1 h 后,加入RAGE、TGF-β1、Smad4、fibronectin、claudin-5、collagen Ⅳ和GAPDH 一 抗,4℃孵 育 过夜;TBST 洗膜3 次,每次5 min,加入二抗37 ℃孵育2 h;TBST 洗膜3 次,ECL 发光、显影、定影后室温下晾干、扫描,以GAPDH 作为内参,凝胶图像处理系统分析各目标带的分子量和净光密度值,获取目的蛋白的相对表达量。
2.5 统计学方法 采用SPSS 23.0 进行统计学分析。 计量资料属正态分布的以(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用最小显著性差异法(LSD 法)。
3.1 3 组大鼠一般情况比较 见表1。
表1 各组大鼠一般情况比较(±s)
表1 各组大鼠一般情况比较(±s)
注:与正常组比较,1) P<0.05;与模型组比较,2) P<0.05。
脑实质重量/g 1.91±0.15 1.59±0.031)1.73±0.061)组别正 常 组模 型 组益景汤组n 10 10 10体质量/g 519.02±21.39 196.28±22.491)211.30±27.301)脑体积/cm3 3.81±0.66 2.09±0.291)3.49±0.592)
3.2 3 组大鼠脑微血管的光镜观察 重点观察3 组大鼠脑组织海马区域。 正常组脑组织见少量毛细血管增生,管壁薄,无充血、出血;益景汤组与正常组比较,毛细血管略增生,管壁稍增厚,管腔稍充血;与模型组比较,毛细血管增生缓解,血管壁相对较薄,未见明显充血及出血区域。 见图1。
图1 光镜下3 组大鼠脑微血管形态观察(×400)
3.3 3 组大鼠脑神经细胞的光镜观察 重点观察3 组大鼠脑组织海马区域。 正常组脑组织海马结构清晰,神经元、胶质细胞数量及形态正常;益景汤组与正常组比较,胶质细胞数量明显增加;与模型组比较,缺血神经元明显减少,未见神经纤维缠结,胶质细胞数量增多、体积增大。 见图2。
图2 光镜下3 组大鼠脑神经细胞形态观察(×400)
3.4 3 组对大鼠TGF-β1/Smads 信号通路相对蛋白表达量比较 见图3。
图3 3 组TGF-β1/Smads 信号通路相对蛋白表达量比较
DE 是DM 微血管并发症之一, 其发病原因可能与脑微血管病变导致脑部缺血有关[14-15]。 与机体其他血管系统比较,脑微血管分布错综复杂,机体为了保障脑内微环境的稳定,形成了一个特殊的微血管结构——血脑屏障(BBB),主要由血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成[16-17]。 血管内皮细胞通过紧密连接蛋白彼此紧密连接,奠定了BBB最基本的结构基础,血管基底膜进一步维持其结构的稳定性。claudin-5 是构成细胞间紧密连接的主要组分,在内皮细胞上高表达,有研究表明claudin-5 缺失会导致BBB 发生选择性渗漏[18]。 BBB 的基底膜主要由细胞外基质组成, 包括fibronectin、collagenⅣ等[19]。
有研究表明:机体在长期高血糖状态下,AGEs 过度积累,与脑血管内皮细胞与周细胞表面的RAGE结合,激活下游信号通路,导致脑微血管病变[20]。TGF-β1/Smads 信 号 通 路 是 其 中 的 重 要 通 路[21],AGEs 与RAGE 结合后,诱导脑血管内皮细胞、周细胞表达TGF-β1,激活Smads 信号通路,Smad2/3 磷酸化后与关键亚基Smad4 形成异聚复合体,将信号从胞浆转移到胞核中。 一方面诱导脑血管内皮细胞、周细胞分泌fibronectin、collagenⅣ,导致血管基底膜增厚,管腔变窄,加上糖尿病患者脂质代谢紊乱,血液黏稠度升高,血流缓慢,导致微血栓形成或微血管闭塞,使脑血流灌注明显减少;另一方面抑制内皮细胞分泌claudin-5,破坏细胞间的紧密连接,破坏BBB 的完整性,使BBB 通透性升高,破坏大脑微环境的稳态,引起神经元的损害和凋亡,最终导致DE 的发生[22]。
中医学认为DE 属于“健忘”“呆症”范畴,基本病机以气阴两虚为本,以血瘀为标。 长期糖尿病导致气虚血行无力,瘀血内停,阻滞脑络,蒙蔽脑窍。因此DE 的中医治疗应以“益气养阴、活血通络”为原则。
益景汤是我院用于防治早期DM 微血管病变的有效经验方,临床应用20 余年,是福建省名老中医金威尔在益气活血名方——补阳还五汤的基础上,去地龙,加山药、苍术、茯苓、玄参、生地黄而成。方中生黄芪益气,生地黄、玄参养阴生津,山药、苍术、茯苓健脾,桃仁、红花、当归、川芎、赤芍活血化瘀。 全方共奏益气养阴、活血通络之功效,组方符合中医防治DE 的基本原则, 具有中医 “治本” 的优势。 团队前期临床研究表明:益景汤对于改善DM患者眼部、心肌、肾脏微血管循环,保护相应脏器功能均有一定的疗效[4-13]。
本研究结果显示:①高血糖导致大鼠体质量明显减轻,脑实质萎缩,大脑体积下降,益景汤可以改善这些症状,对大脑正常体积的维持作用尤为明显;②高血糖导致大鼠脑组织缺血神经元明显增多,甚至出现神经纤维缠结(神经元的一种病理变化,与老年性痴呆相关),益景汤可以缓解高血糖导致的脑部缺血性变化,缓解脑萎缩,改善脑部血流灌注;③高血糖导致大鼠脑组织TGF-β1/Smads 信号通路的关键蛋白TGF-β1 和Smad4 表达升高,下游血管相关结构蛋白fibronectin 和collagenⅣ表达升高,claudin-5 表达降低,提示该通路是DM 脑微血管病变的发病机制之一。益景汤可以通过调节TGFβ1/Smads 信号通路相关蛋白的表达异常,保护细胞间的紧密连接,保护血管基底膜,对于维持脑微血管正常结构及功能有一定的效果。
综上,益景汤能一定程度的改善早期DM 大鼠的消瘦和脑组织萎缩,并通过调节TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达,改善DM 大鼠早期脑微血管损害,改善脑部血流灌注。 对TGF-β1/Smads信号通路的调控可能是益景汤干预早期DM 脑微血管病变的作用机制之一。