青蒿琥酯通过NLRP3炎症小体抑制细胞焦亡减轻大鼠肾缺血-再灌注损伤

袁强 申开文 张瑞波 王强 吴玉婷 沈俊

肾缺血-再灌注损伤（ischemic-reperfusion injury，IRI）是一种严重的临床综合征，常见于肾移植手术，是影响肾移植受者术后恢复的主要因素之一[1-2]。炎症反应作为IRI主要发病机制之一，对于IRI导致的肾损伤具有重要意义。肾移植作为终末期肾病的重要治疗方式之一，可明显改善终末期肾病患者的生活质量。因此，通过减轻肾IRI中相关炎症反应，对于肾移植受者具有重要意义。然而，目前仍然缺乏通过减轻炎症反应治疗肾IRI的有效途径。研究表明，NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1 前体蛋白共同参与NLRP3炎症小体的组成，与炎症反应息息相关[3-4]。

青蒿琥酯作为由青蒿素衍生而来的水溶性半合成化合物，除具有强大的抗疟疾功效，还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[5-8]。近年来，因其显著的抗炎作用逐渐引起关注，有研究表明青蒿琥酯对于炎症具有积极的治疗作用[7-8]。目前仍缺乏青蒿琥酯在肾IRI中作用的相关报道，本研究旨在探讨青蒿琥酯对大鼠肾IRI的影响及其机制，为促进临床肾移植受者术后恢复提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠25只，体质量200～220 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司。大鼠于40%～70%湿度、温度20～26 ℃、昼夜12 h明暗交替、自由饮水和进食条件下饲养。本实验获得贵州医科大学动物伦理委员会批准（2001317）。

青蒿琥酯购于江苏恒瑞医药股份有限公司，NLRP3炎症小体抑制剂INF39购于美国Selleck生物科技有限公司，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液购于武汉阿斯本生物技术有限公司，高碘酸购于汕头西陇化工厂有限公司，碱性品红购于上海蓝季科技发展有限公司，血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）测定试剂盒购于苏州格锐思生物科技有限公司，血清白细胞介素（interleukin，IL）-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

免疫组织化学（免疫组化）抗体：IL-1β一抗购于美国GeneTex公司，二抗购于武汉阿斯本生物技术有限公司。免疫荧光抗体：Gasdermin D（GSDMD）一抗购于武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司公司，NLRP3一抗购于江苏亲科（Affinity Biosciences）生物研究中心有限公司，Caspase-1一抗购于美国Santa Cruz公司，二抗购于武汉阿斯本生物技术有限公司。蛋白质印迹抗体：肾损伤分子（kidney injury molecule，KIM）-1一抗购于美国ThermoFisher公司，NLRP3、GSDMD、IL-1β一抗购于英国Abcam公司，Caspase-1购于江苏亲科（Affinity Biosciences）生物研究中心有限公司，二抗均购于武汉阿斯本生物技术有限公司。

1.2 模型建立与分组

将所有大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）、模型组（IRI组）、低剂量青蒿琥酯组（ART-L组）、高剂量青蒿琥酯组（ART-H组）和INF39组，每组5只。建模前2 h，ART-L组和ART-H组大鼠分别腹腔注射15 mg/kg、30 mg/kg 青蒿琥酯[9]，INF39组大鼠腹腔注射7.5 mg/kg INF39[10]，IRI组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

根据大鼠的体质量，腹膜注射3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉后，沿腹中线切开腹部，小心游离暴露双侧肾蒂后，用微动脉瘤夹钳夹住双肾蒂周围45 min后松开双侧夹钳。通过颜色变化监测缺血及再灌注是否成功。Sham组大鼠仅开腹游离暴露双侧肾蒂。用缝合线缝合腹部切口。手术后饲养24 h，对大鼠实施安乐死，收集血清和肾组织进行分析。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠肾功能检查 采用试剂盒检测各组大鼠BUN和Scr水平。

1.3.2 酶联免疫吸附试验 采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒检测各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平。

1.3.3 病理学检查 新鲜肾组织固定于4%多聚甲醛24 h以上，脱水后包埋在石蜡中。石蜡切片脱蜡水洗后进行HE染色和过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色。

1.3.4 免疫组化染色 肾组织石蜡切片脱蜡后水洗，抗原修复，封闭。IL-1β一抗（1∶300）覆盖切片4 ℃孵育过夜，洗涤后辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联的山羊抗兔二抗（1∶200）孵育，3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）在显微镜控制下染色，用光学显微镜CX-21观察和MicroPublisher获取图像，细胞核或细胞质染色呈黄褐色为阳性染色。

1.3.5 蛋白质印迹法 提取各组大鼠肾组织蛋白，检测KIM-1以及焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达。一抗覆盖聚偏氟乙烯膜4 ℃孵育过夜，洗涤后HRP偶联的二抗孵育1 h。使用化学发光对印迹进行检测，并通过Image J软件进行分析。

1.3.6 免疫荧光染色 肾组织石蜡切片脱蜡后水洗，抗原修复，封闭。载玻片滴加NLRP3一抗（1∶100）、Caspase-1一抗（1∶50）、GSDMD（1∶100）4 ℃孵育过夜，洗涤后荧光二抗孵育50 min，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液孵育5 min，使用抗荧光淬灭剂封片。使用荧光显微镜IX51观察和MicroPublisher获取图像。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.01软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青蒿琥酯对大鼠肾IRI后肾损伤及血清学指标的影响

各组大鼠肾组织HE染色结果显示，与Sham组比较，IRI组肾组织损伤较重，部分肾小管萎缩变性，小管上皮出现颗粒变性或水样变性，细胞刷状缘脱落，可见蛋白管型、细胞管型改变及间质炎症充血表现（图1A）。各组大鼠肾脏组织PAS染色结果显示，与Sham组比较，IRI组大鼠肾组织部分肾小管上皮明显萎缩，刷状缘脱落，肾小管可见上皮细胞空泡化改变（图1B）。ART-L组、ART-H组及INF39组损伤较IRI组均减轻。

图1 各组大鼠肾组织病理学表现Figure 1 Renal histopathological features of rats in each group

IRI组的Scr和BUN水平较Sham组升高 ；ART-L组、ART-H组和INF39组Scr、 BUN水平较IRI组均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图2）。与Sham组比较，IRI组KIM-1蛋白表达水平升高；与IRI组比较，ART-L组、ART-H组及INF39组KIM-1蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图3）。

图2 各组大鼠肾功能血清学指标Figure 2 Serum indexes of renal function of rats in each group

图3 各组大鼠肾组织KIM-1蛋白表达水平Figure 3 The expression levels of KIM-1 protein in renal tissues of rats in each group

2.2 青蒿琥酯对大鼠肾IRI后肾组织及血清炎症因子的影响

免疫组化染色结果显示，与Sham组比较，IRI组、ART-L组、ART-H组及INF39组IL-1β表达增多；与IRI组比较，ART-L组、ART-H组和INF39组IL-1β表达均减少（图4）。ELISA检测结果显示，与Sham组比较，IRI组、ART-L组、ART-H组及INF39组TNF-α、IL-6水平均升高；与IRI组比较，ART-L组、ART-H组和INF39组TNF-α、IL-6水平均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图5）。

图4 各组大鼠肾组织IL-1β的表达情况Figure 4 Expression of IL-1β in renal tissues of rats in each group

图5 各组大鼠血清炎症因子的水平Figure 5 The levels of inflammatory factors in serum of rats in each group

2.3 青蒿琥酯对大鼠肾IRI后肾组织焦亡相关蛋白表达的影响

与Sham组比较，IRI组中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达水平均升高；与IRI组比 较，ART-L组、ART-H组 和 INF39组NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图6A）。

图6 各组大鼠肾组织焦亡相关蛋白的表达情况Figure 6 Expression of pyroptosis related proteins in renal tissues of rats in each group

免疫荧光染色结果（图6B、C）显示，与Sham组比较，IRI组NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达均增多；与IRI组比较，ART-L组、ART-H组和INF39组NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达均减少。

3 讨 论

肾IRI是一种常见的危重疾病，肾脏作为高灌注器官，对缺血缺氧十分敏感。目前，肾移植术中IRI的预后及转归效果常不能达到理想状态，显著增加了受者的住院时间。肾小管上皮细胞受损及炎症反应在肾IRI中扮演了重要角色，可加速慢性肾病的发展[11-12]。肾IRI中相关炎症反应主要病理过程表现为间质性炎症。肾IRI后，肾脏近曲小管、肾小球系膜细胞等可释放一系列促炎因子，经过血管内皮细胞到达损伤组织，进一步加重损伤[13]。

肾IRI过程会发生包括细胞焦亡在内的多种细胞死亡方式。细胞焦亡作为一种近年来发现的细胞死亡方式，其启动发生较细胞凋亡等更快，是一种受调控并同时伴有大量炎症介质释放的程序性细胞死亡方式，其特征是细胞肿胀、细胞膜上形成孔洞和释放促炎因子[14-15]。这一过程需要NLRP3炎症小体和GSDMD的参与[16]。一旦发生焦亡反应，GSDMD的N-端聚集并与脂类结合，在细胞膜上形成孔洞，细胞逐渐膨胀至细胞破裂，最终使包括IL-1β在内的大量细胞内含物释放，激活强烈的炎症反应[17-18]。

焦亡介导的炎症反应参与了肾IRI。NLRP3炎症小体及GSDMD在焦亡中发挥了重要作用，对于诱导炎症因子的产生至关重要，可反映炎症反应的程度。NLRP3炎症小体作为肾IRI中关键的因素，可在多种急性和慢性肾病的发病机制中发挥重要作用。大量研究表明，NLRP3炎症小体参与了肾脏炎症反应及肾损伤[19-22]。因此，抑制NLRP3炎症小体的表达对于肾IRI的防治具有巨大的潜力。NLRP3炎症小体在肾脏的足突细胞和肾小管上皮细胞中均可被激活，并增加相关炎症因子的表达[23]。然而，目前对于其治疗仍缺乏有效手段。本研究结果显示，大鼠肾IRI后，炎症因子的释放增加，肾损伤情况加重。而经青蒿琥酯预处理的大鼠，NLRP3炎症小体表达减少，相关炎症因子释放减少，肾组织损伤得到明显的改善，效果与INF39预处理相似，表明青蒿琥酯能够通过抑制肾IRI后NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡，减轻大鼠肾损伤。

青蒿琥酯作为青蒿素的衍生物，凭借其优越的抗炎作用被用于多种疾病的治疗，效果得到了广泛的认可。相关研究表明，青蒿琥酯可通过减轻炎症反应，在心脏IRI、脑IRI及糖尿病肾病中发挥保护作用[24-27]。有研究表明，青蒿琥酯可通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用[24]。本研究发现，青蒿琥酯预处理后NLRP3炎症小体、GSDMD及相关炎症因子的表达明显减少，表明青蒿琥酯能在肾IRI中发挥显著的抗炎作用，减少焦亡相关蛋白的表达及肾组织损伤。

综上所述，青蒿琥酯可抑制NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡，减少肾IRI后焦亡相关蛋白的激活及炎症因子的释放，减轻肾IRI。