黑曲霉GOD基因在枯草芽孢杆菌中的表达

于思颖 程 鹏 张静博 曹平华 李元晓 马彦博 李 旺

河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，FAD）的二聚体蛋白酶，能够特异性催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和过氧化氢[1]。GOD 基于其安全无毒等特性广泛地应用于饲料添加剂、食品、制药和化学等领域[2-7]。

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为一种革兰氏阳性菌，已被美国食品药品监督管理局（FDA）评为生物安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]，具有易于培养、繁殖速度快、遗传背景清晰等特点。与大肠杆菌相比，其具有优异的蛋白分泌能力，方便下游表达产物的分离；同时，B.subtilis具有良好的发酵工艺技术，这为目的产物进一步扩大生产提供了基础。B.subtilis表达系统已表达了多种产物并广泛应用于制药、食品和饲料等行业中[9-13]。

目前，大部分GOD 为野生菌或诱导菌生产，存在酶活力低且后续纯化困难等问题，基因工程表达的GOD宿主多为毕赤酵母，由于毕赤酵母的表达往往需要甲醇诱导，难以直接应用于饲料和养殖生产。因此，本研究克隆了来源于黑曲霉的GOD 基因，以野生型动物益生菌为宿主，以期获得高效表达GOD 的枯草芽孢杆菌，推动其在动物养殖中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）土样：采自河南省洛阳市某葡萄园，采用多点混合法采集0～10 cm的土壤。

2）菌株、质粒和引物见表1。

表1 本试验所用菌株、质粒和引物

3）主要试剂：邻联茴香胺、辣根过氧化物酶、真菌DNA提取试剂盒购自上海生工生物有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白质Marker 购自Takara 公司；T4DNA 连接酶、NotI、NdeI、HindⅢ限制性内切酶购自Sigama 公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

4）培养基。

①平板分离培养基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸铵0.4 g/L、磷酸二氢钾0.19 g/L、硫酸镁0.16 g/L、碳酸钙3.5 g/L、可溶性淀粉10 g/L、碘化钾1.7 g/L、脱氧胆酸钠0.2 g/L、加入适量链霉素（100 μg/mL）、琼脂粉15 g/L、磷酸缓冲液0.1 mol/L，pH为5.6。

②发酵培养基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁0.7 g/L、氯化钾0.5 g/L、硝酸钠0.4 g/L、碳酸钙3.5 g/L，自然pH。

③PDA 培养基：马铃薯200 g（加水1 L，煮沸30 min，纱布过滤），葡萄糖20 g，补水至1 L，自然pH，配制固体培养基时加入琼脂粉20 g/L。

④LB 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0，121 ℃下灭菌20 min，配置固体培养基时加入琼脂粉20 g/L。抗性培养基中Amp的最终质量浓度是100 μg/mL。

1.2 试验方法

1）菌株筛选。采用Fiedure.K.J 显色法，称取10 g 采集的土样置于灭菌的装有100 mL生理盐水且带有适量玻璃珠的250 mL锥形瓶中，28 ℃，160 r/min振荡培养30 min。然后用无菌水稀释上清液至10-3、10-4、10-53个稀释度，分别用无菌枪头吸取100 μL 涂布于预先配制且灭菌的平板分离培养基，28 ℃培养3 d 后置于4 ℃冰箱中静置，观察蓝紫色颜色圈，选取较大颜色圈中的菌株接种于PDA 斜面培养基，28 ℃培养至长出成熟孢子，保存于4 ℃。将初筛得到的斜面培养的菌株接种于发酵培养基中，28 ℃、180 r/min摇床振荡培养5 d，取发酵上清液及菌体测酶活。

2）酶活力测定方法。

①葡萄糖氧化酶酶活的定义：在pH 5.6，温度为30 ℃的条件下，每分钟催化1 μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶的量定义为1个酶活力单位（U）。

②底物体系：吸取1 mL 5%葡萄糖溶液，2 mL 0.07 g/L 邻联茴香胺溶液，0.1 mL 60 U/mg 辣根过氧化物酶溶液于同一试管中，30 ℃恒温水浴10 min。

③酶活测定：吸取0.1 mL 稀释10 倍后的粗酶液于底物中摇匀，于波长460 nm 处每1 min 记录1次吸光度值（A460nm），共测定5 min，以A460nm对时间作图，计算最大斜率ΔA（min），根据下式计算酶活（X）：

X=ΔA*f/（11.3*t*V1/V2）

式中：f为粗酶液稀释倍数；11.3 为消光系数；t为感应时间，min；V1为粗酶液体积，mL；V2为反应液总体积，mL。

3）基因组DNA的提取与目的基因的克隆。

①菌体的预处理：采用PDA 培养基平板活化待测菌株，于28 ℃培养至长出褐色孢子，之后接种于PDA 液体培养基，30 ℃、180 r/min 振荡培养2～3 d，过滤出菌体，-80 ℃冻存。

②基因组DNA 的提取与鉴定：取冻存的菌体，在液氮中研磨，称取0.2 g 研磨后的菌体，参照真菌DNA 抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，-20 ℃保存备用。采用真菌通用引物ITS1与ITS4 对5.8S rDNA-ITS 区序列进行PCR 扩增（94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，运行35 个循环，72 ℃终延伸10 min），PCR 反应产物送至北京六合华大基因公司测序。

③目的基因的克隆：根据NCBI GenBank 上已公布的黑曲霉GOD 基因序列（登录号：MH593586.1），设计克隆GOD 基因所用的特异性引物F、R。以黑曲霉基因组DNA 为模板，F、R 为引物进行PCR 扩增（98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，运行30 个循环），PCR 产物经纯化回收后得到GOD 基因片段，连接pGEM-T Easy 载体，并转化E.coliDH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白斑单菌落经菌落PCR 鉴定获得阳性克隆子，提取pGEM-T-GOD 质粒双酶切验证后送测序，保存测序正确的菌株。

4）重组表达质粒的构建。结合枯草芽孢杆菌密码子偏好性，对黑曲霉GOD编码序列进行密码子优化，优化后的氨基酸序列及核酸序列如下，在N端加上了34 个氨基酸信号肽（绿色部分），C 端加上了His-tag（红色部分）。在核酸序列两端添加NdeI（黄色序列）和HindⅢ（灰色序列）酶切位点，核酸序列全长1 902 bp，编码629 个氨基酸，蛋白分子量约68.44 ku，序列交由公司（南京金斯瑞）合成。

氨基酸序列：MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAE-Protein-HHHHHH..

核酸序列 pGOD：CATATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTAC

TGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTC ATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAA-DNAsequence-CACCACCATCATCATCATTAATGAAAGCTT

分别酶切目的片段GOD 和载体质粒pT7M，用胶回收试剂盒将片段GOD 的酶切产物和质粒pT7M的酶切产物回收纯化。在T4 DNA 连接酶的作用下构建重组质粒pT7M-GOD，转化E.coli DH5α，经Amp（氨苄青霉素）抗性平板筛选和双酶切鉴定，同时送至华大基因公司测序验证，保存测序正确的菌株。

5）枯草芽孢杆菌的转化及诱导表达。将鉴定正确的重组质粒pT7M-GOD通过化学转化的方式转入枯草芽孢杆菌7024E感受态中，在37 ℃、200 r/min摇床复苏培养60 min 后涂于含有12.5 μg/mL 四环素的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜。选取3株长势良好的单菌落，分别接种于含有12.5 μg/mL 四环素的4 mL LB 培养基中，分为3 组，37 ℃、200 r/min 振荡培养至OD600值达0.6～0.8 时，第1 组作为阴性对照，不添加诱导剂；第2组加入终浓度为2%木糖诱导表达，25 ℃诱导培养16 h；第3 组加入终浓度为2%木糖诱导表达，37 ℃诱导培养4 h。

6）目的基因的表达。收集培养物上清与菌体沉淀，在沉淀中加入裂解液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0），用超声波破碎仪破碎。分别取培养物上清，全细胞裂解液，破碎液上清与沉淀，加入5×loading buffer 混匀，煮沸10 min，通过SDSPAGE 检测粗蛋白的表达情况，通过制备单克隆抗体，利用Westen-blot检测目的基因的表达。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选与鉴定

通过对采集的土样进行初筛和复筛，得到4 株产胞内GOD 酶活较高的菌株，测得酶活力如表2所示，由表2可以看出，菌株P-1 产酶性能较好，发酵5 d 后发酵液中GOD 酶活为2.820 U/mL，选定菌株P-1为出发菌株进行后续研究。

表2 分离菌株产GOD酶活测定结果

分析菌株P-1 的生长及形态特征，与曲霉鉴定手册中黑曲霉比较接近。利用真菌通用引物ITS1/ITS4，扩增菌株P-1 的ITS 区基因，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，结果与理论编码序列大小相符，如图1所示。将测序得到的菌株P-1 IST 区基因序列在NCBI 中进行BLAST 分析，并构建系统发育树见图2。由图2可知，与GenBank 数据库中曲霉菌相关菌株的ITS 区基因序列的5.8S rDNA-ITS 区序列比较分析，发现其与曲霉属（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）亲缘关系最近。综合菌株的菌落形态、生长特性及5.8S rDNA-ITS 区序列系统进化分析，确定菌株P-1为黑曲霉。

图1 菌株P-1的IST区基因PCR产物

图2 菌株P-1的5.8S rDNA ITS区序列系统发育树

2.2 目的基因的克隆与鉴定

以黑曲霉P-1基因组DNA为模板，利用引物F、R 进行PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图3A。质粒pGEM-T-GOD 经酶切，结果如图3B。测序结果显示，目的基因片段全长1 818 bp，编码605 个氨基酸，将其序列与GenBank 中公布的GOD 基因序列进行比对，相似度为81%～99%，证明成功扩增了黑曲霉GOD基因，命名为pGOD。

图3 pGOD基因的PCR 扩增（A）和pGEM-T-pGOD的酶切鉴定（B）

2.3 重组表达质粒的构建与鉴定

重组质粒pT7M-GOD 经双酶切验证，结果显示GOD 基因已经插入到表达载体pT7M 中（图4）。重组质粒的测序结果显示，目的基因序列与优化后pGOD 的序列完全一致，重组表达载体pT7M-pGOD构建正确。

图4 pT7M-GOD的双酶切鉴定

2.4 目的基因的表达

将鉴定正确的重组质粒pT7M-pGOD 转入枯草芽孢杆菌7024E 感受态中，经2%木糖诱导发酵培养后的SDS-PAGE 分析结果见图5。结果显示，1，2泳道和7，8泳道可见约68 ku大小的条带，与理论上pGOD蛋白的分子质量大小一致。且2、8泳道明显比1、7泳道的表达量高。结果表明，pGOD 基因能够在枯草芽孢杆菌中表达，且在37 ℃培养4 h 表达量较高。

图5 pGOD蛋白表达产物的SDS-PAGE

制备单克隆抗体，利用Westen-blot对表达的粗蛋白进行检测，结果如图6所示，在样品3、4、5、6 中出现明显的目的基因产物。大小与预期pGOD蛋白分子质量一致，说明该表达系统成功表达了pGOD基因，属于胞内表达的可溶性蛋白。

图6 表达产物Western-blot检验

3 讨 论

GOD 作为一种新型的酶制剂，近年来在养殖行业应用广泛，GOD 可以改善动物肠道环境，增强肠道有益菌群，降低霉菌毒素中毒损伤，提高内源酶活，提高饲料消化率。大量的文献报道表明产GOD的菌种主要是曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）[14-16]，本研究从土壤样品中筛选到产GOD 的微生物，经鉴定为黑曲霉，也验证了这一结论，说明霉菌是产GOD的主要微生物菌种。

但天然菌株发酵生产GOD 的酶活性低，且纯化工艺复杂。因此，构建高效表达GOD的重组菌株成为主要研究方向。近十几年来，多种来源的GOD基因被克隆[17-18]，本研究所扩增的GOD 基因片段全长1 818 bp，编码605 个氨基酸，将其序列与GenBank中公布的GOD 基因序列进行比对，相似度为81%～99%，部分位点的碱基出现差异，其主要原因是不同物种的编码基因有差异。所克隆的GOD 基因在大肠杆菌（Escherichia coli）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（P. pastoris）等宿主中成功表达[19-22]，并且酶活性得到显著提高。如陈楠等[23]利用具有AOX1 强启动子的表达载体pPICZαA，在毕赤酵母SMD1168 中成功表达了黑曲霉PCTC GOD 基因，并对重组菌进行产酶条件优化，优化后酶活达32 U/mL，提高了27倍。然而在动物益生菌枯草芽孢杆菌中表达GOD基因的未见报道，B. subtilis属于动物益生菌，发酵条件简单，目前已有很多的研究报道使用B.subtilis作为高效生产的工程菌株[24-25]。加之为了更好地服务于养殖和饲料，本研究将GOD基因在野生型枯草芽孢杆菌中进行了表达，成功获得了表达产物。但由于是异源表达，需对目的基因的密码子进行优化[26-27]，通过密码子优化构建表达载体pT7M-pGOD，使枯草芽孢杆菌成功地表达了来源于黑曲霉的GOD基因，为构建高效表达GOD的基因工程菌提供了新的思路。

4 结 论

从土壤样品中筛选出1 株高产葡萄糖氧化酶（GOD）的黑曲霉菌株，将黑曲霉菌的GOD基因克隆到载体pT7M，重组质粒pT7M-pGOD 转化到枯草芽孢杆菌中异源表达，获得了产GOD的枯草芽孢杆菌工程菌株。