不同保存条件及反复冻融对血清HCV抗体检测的影响

江雅平， 李智慧， 李志艳， 王玎玲

（北京大学第一医院检验科，北京 100034）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗体的准确测定是诊断丙型肝炎的关键，全面质量管理是获得准确测定结果的重要保证。样本分析全过程的不当处理均会影响检验结果的准确性[1]。分析前产生的误差占整体误差的60%以上[2]。分析前影响因素包括样本的采集、前处理、储存等[3]。样本储存时，血细胞的各种代谢活动均会直接影响样本的质量[4]。采集的血清样本应及时检测，但在实际工作中，待测样本常在常温或4 ℃条件下运送至实验室；由于基层医疗机构血样本不是集中采集，血清常置于低温保存一定时间后检测；科研所用样本通常冻存于-80 ℃后进行批量检测，因此不可避免地会在反复冻融后检测。我们在实际工作中发现，留取的HCV抗体阳性（S/CO值≥1）血清样本冻存后再次检测，HCV抗体水平较之前会大幅下降。查阅文献，未能找到不同储存条件和反复冻融对血清HCV抗体检测结果影响的相关研究。为此，本研究在进行严格质量控制的前提下，分析HCV抗体的最优储存条件，为分析前的质量控制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样本来源

采用分离胶真空采血管采集北京大学第一医院门诊及住院患者的静脉血，2 290×g离心10 min，分离血清，肉眼观察均无脂血、黄疸和溶血。将当天采集、当天检测的50份血清样本用于探讨不同保存温度、保存时长对血清样本HCV抗体测定结果的影响。将HCV抗体基线S/CO值<1的15例样本、S/CO值为1～<2的17例样本、S/CO值为2～<5的14例样本、S/CO值≥5的15例样本用于分析反复冻融对HCV抗体检测的影响。

1.2 方法

1.2.1 HCV抗体检测 所有样本均采用ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析系统（美国雅培公司）及配套试剂由同一名工作人员完成检测。HCV抗体质控检测当天均在控，保证检测数据稳定、可靠。以S/CO值≥1判定为HCV抗体阳性。

1.2.2 不同保存温度对HCV抗体的影响 将收集的50份血清样本中的每份均分为4份，分装于2.0 mL螺口冻存管（美国Nunc公司）中，及时盖盖，防止血清样本蒸发。分装后立即将4份样本分别置于常温、4 ℃、-20 ℃及-80 ℃条件保存，分别在保存后1、3、5、7 d再次取出检测HCV抗体水平。将50份血清样本当天检测的HCV抗体结果作为基线水平。

1.2.3 反复冻融对HCV抗体的影响 将收集的61份血清样本中的每份样本均分为2份，分装于2.0 mL螺口冻存管（美国Nunc公司）中，分别置于-20 ℃和-80 ℃冻存，2 h后解冻，并检测HCV抗体，测定完成后立即冻存2 h，反复冻融4次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈非正态分布的计量数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，多组间比较采用相关变量非参数Friedman检验，两两比较采用配对样本Wilcoxon检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 50份血清样本不同温度不同保存时间HCV抗体水平

以当天检测的50份血清样本HCV抗体结果作为基线水平，S/CO值为0.59～6.12，M（P25～P75）为0.86（0.78～0.94），其中有9份血清样本HCV抗体阳性（S/CO值为1～<2的6份，≥2的3份。与基线水平比较，常温和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗体水平差异均无统计学意义（P>0.05）；-20 ℃和-80 ℃保存1 d的HCV抗体水平显著降低（P<0.05），且保存时间越长，HCV抗体水平下降幅度越大。在保存天数相同的情况下，-20 ℃和-80 ℃保存的HCV抗体结果低于常温和4 ℃保存（P<0.001）。见表1。

表1 不同温度不同保存时间血清HCV抗体水平（S/CO）值比较 M（P25～P75）

2.2 不同保存温度和保存时间50份血清样本HCV抗体阳性情况

50份血清样本中，有9份（18%）HCV抗体阳性，其中S/CO值为1～<2的6份，≥2的3份。常温和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗体阳性率无变化。-20 ℃和-80 ℃保存1 d，6份S/CO值为1～<2的阳性样本中分别有3份和4份转为阴性；保存3 d，6份S/CO值为1～<2的阳性样本均转为阴性；S/CO值≥2的3份阳性样本-20 ℃和-80 ℃保存1、3、5、7 d结果无变化。见表2。

表2 不同保存温度、不同保存时间血清样本HCV抗体阳性的变化

2.3 反复冻融对HCV抗体检测的影响

与基线水平比较，61份血清样本的HCV抗体检测结果随冻融次数的增加而逐渐降低（P<0.001）。在冻融次数相同的情况下，-20 ℃与-80 ℃保存的样本HCV抗体检测结果之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 反复冻融后血清样本HCV抗体检测结果（S/CO）值的变化 M（P25～P75）

2.4 不同冻融次数对HCV抗体阳性率的影响

61份血清样本-20 ℃和-80 ℃冻融2次后分别有8份、9份样本的HCV抗体结果由阳性转变为阴性；冻融3次分别有9份、10份转变为阴性；冻融4次分别有11份、11份转变为阴性。

2.5 不同S/CO值样本反复冻融后HCV抗体S/CO值的变化

对于基线S/CO值<1的血清样本，-20 ℃和-80 ℃冻融1次，S/CO值下降均>40%；冻融3次，S/CO值下降均>50%。对于基线S/CO值为1～<2的血清样本，-20 ℃和-80 ℃冻融1～4次，S/CO值分别下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。对于基线S/CO值为2～<5的血清样本，-20 ℃和-80 ℃冻融1～4次，S/CO值分别下降30.92%～49.80%和30.90%～49.78%。对于基线S/CO值≥5的血清样本，-20 ℃和-80 ℃冻融1次，S/CO值分别下降9.99%和8.94%；冻融4次，S/CO值下降均<20%。见表4。

表4 不同温度反复冻融后HCV抗体S/CO值的下降百分比 %

3 讨论

HCV抗体是HCV感染筛查的主要指标。HCV感染可导致肝脏发生慢性炎症和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。由于部分基层医疗机构每天的样本量有限，难以做到即刻检验，需将样本低温保存后统一检测；还有一些实验室出于日后复查或科研的考虑，对一些已完成检测的样本进行低温保存，因此有些检测结果可能会受保存条件或反复冻融的影响[5]。

关于血清样本反复冻融对各项检测指标的影响，国内外已有报道。GUNASEKARA等[6]的研究结果显示，血清总胆固醇和三酰甘油反复冻融10次以上，检测值与初始值相比无显著变化（P>0.05）。CUHADAR等[7]的研究结果显示，反复冻融1～10次对血清尿素氮、尿酸、总蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶等有显著影响，对天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和γ-谷氨酰基转移酶等指标无显著影响。余国庆[8]等的研究结果显示，血清胃蛋白酶原Ⅰ水平在-20 ℃冻融2次后显著降低，胃蛋白酶原Ⅱ水平在冻融3次后显著下降。HILLEBRAND等[9]的研究结果显示，血浆肾素活性在-20 ℃冻融2次后升高，促肾上腺皮质激素水平在冻融3次后显著降低，而总三碘甲状腺原氨酸（total triiodothyronine，TT3）、总甲状腺素（total thyroxine，TT4）、反三碘甲状腺原氨酸（reverse triiodothyronine，rT3）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）、促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、甲状腺球蛋白、胰高血糖素水平在冻融3次后无明显变化。然而，司学众等[10]的研究结果显示，与基线水平比较，血清样本-25 ℃冻融1次，除TSH外，TT3、TT4、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）和FT4水平差异均有统计学意义（P<0.05）；冻融 2次后，TT3、TT4、FT3、FT4和TSH水平差异均有统计学意义（P<0.05）。导致研究结果不一致的原因可能与冻存温度、检测系统[HILLEBRAND等使用的是AutoDelfia时间分辨荧光免疫分析仪（芬兰珀金埃尔默公司），司学众等使用的是ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析系统]、检测方法等不同有关。国内已有关于不同储存条件和时间对HCV RNA检测结果影响的报道[11]，但尚未见对HCV抗体检测影响的报道。为此，本研究探讨了保存条件和反复冻融对HCV抗体检测结果的影响。

本研究设常温、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃ 4种储存温度，在相同时间点检测，消除了放置时间对检测结果的影响，结果显示，血清样本在常温或4 ℃保存7 d，HCV抗体的S/CO值未发生显著变化（P>0.05）；但-20 ℃和-80 ℃保存1 d，HCV抗体水平即显著下降（P<0.001），冻存时间越长，HCV抗体水平下降幅度越大。反复冻融实验结果显示，基线S/CO值越低的样本反复冻融后S/CO值的下降百分比越大。对于基线S/CO值<1的血清样本，不论是-20 ℃，还是-80 ℃保存，冻融1次后HCV抗体检测结果即显著下降，下降幅度>40%；冻融3次后HCV抗体检测结果下降>50%。对于基线S/CO值为1～<2的血清样本，-20 ℃和-80 ℃冻融1～4次，S/CO值分别下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。冻融次数越多，HCV抗体检测结果下降幅度越大。因此，对于S/CO值为1～<2的血清样本，冷冻保存后极易使HCV抗体由阳性转变为阴性，导致漏诊。这可能是由于反复冻融导致血清样本中生物分子降解、活性发生改变或产生不溶性沉淀物，进而导致血清HCV抗体检测结果下降。

综上所述，HCV抗体检测应尽量在采血当天完成，如果无法当天完成，短期宜4 ℃保存，不宜冷冻保存，也不宜冻融。如果需要复测，应在4 ℃保存7 d内完成复测。冷冻保存会对HCV抗体检测产生较大影响，使HCV的检出率下降，进而影响对患者病情的判断。