CLIC4、SNHG3表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后的关系

薛 艳， 王佳佳， 王馥香， 任秋伟

（1.南阳医学高等专科学校第一附属医院产科，河南 南阳 473000；2.南阳医学高等专科学校第一附属医院病理科，河南 南阳 473000；3.南阳医学高等专科学校第一附属医院检验科，河南 南阳 473000）

卵巢癌是临床较为常见的严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。由于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌不易被察觉，多数患者被确诊时已处于晚期，导致患者5年生存率较低。为提高Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌的诊断效率，寻找灵敏、便捷、创伤性小的生物学指标已成为临床研究热点[1]。有研究结果显示，细胞内氯通道蛋白4（chloride intracellular channel protein 4，CLIC4）高表达与多种癌症恶性状态及预后显著相关[2]。有研究发现，30例卵巢癌患者中有28例CLIC4和卵巢癌特异性蛋白α-平滑肌肌动蛋白呈高表达[3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表观遗传、基因转录调控方面显著影响肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移等。小核仁RNA宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）是近期发现的与肝癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤恶性状态及预后不良有关的因子[4-5]，但尚缺少关于SNHG3对Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的诊断及预后预测作用的研究。为此，本研究拟通过探讨Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌组织中CLIC4、SNHG3的表达与临床特征因素之间的关系及其对患者预后的影响，为临床提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的诊断效率提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2012年10月—2015年10月南阳医学高等专科学校第一附属医院行全面分期手术治疗的Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者113例（卵巢癌组），年龄（49.83±9.94）岁。纳入标准：（1）经冰冻及石蜡病理学切片确诊为卵巢癌，采用2013年国际妇产科联盟（the International Federation of Obstetrics and Gynecology，FIGO）分期标准[6]进行病理分期，所有患者分期均处于Ⅰ～Ⅱ期；（2）均为初次诊断，且肝、肾功能均正常；（3）病灶组织仅位于卵巢一侧或双侧，术前、术中检查无腹水或仅有少量腹水；（4）入组前未行放化疗以及盆腔器官手术治疗。另选取同期南阳医学高等专科学校第一附属医院经B超或其他影像学检查及病理组织切片确诊为良性卵巢囊肿的患者76例（对照组），年龄（48.79±9.06）岁。排除标准：（1）有妇科炎症患者；（2）伴有其他肿瘤者；（3）伴有高血压、糖尿病以及心血管等慢性疾病者。本研究经南阳医学高等专科学校第一附属医院伦理委员会批准，所有研究对象或其家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 手术治疗方法 在术中探查腹腔，确定肿瘤位置、性质及包膜的完整情况，同时根据患者有无生育要求等采取不同的手术方式。对于肿瘤最大直径<10 cm的患者行腹腔镜全面分期手术，对于肿瘤最大直径≥10 cm且粘连严重的患者采用开腹全面分期手术。根据术式不同，113例卵巢癌患者中有78例行腹腔镜全面分期手术，35例行开腹全面分期手术。对照组均采用手术治疗。

1.2.2 资料收集 收集所有研究对象的基线资料，包括：（1）年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、经产次数、绝经状况以及月经紊乱情况；（2）卵巢癌患者肿瘤分期、病理类型、肿瘤直径、组织病理学分级以及是否出现转移等；（3）所有研究对象相关指标[糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）]、人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）、CLIC4及SNHG3等]的检测结果，根据CA125、HE4的检测结果及研究对象的绝经情况计算卵巢恶性肿瘤风险（the risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA）指数，用于评估卵巢癌的发生风险，计算公式[7]为：绝经前预测指数（predictive index，PI）=-12.0+2.38×ln（HE4）+0.0626×ln（CA125）；绝经后PI=-8.09+1.04×ln（HE4）+0.732×ln（CA125），式中ln为自然对数；ROMA指数=exp（PI）/[1+exp（PI）] ×100。ROMA指数评价标准：检测特异性为75%时，绝经前ROMA指数>11.4%、绝经后ROMA指数>29.9%提示卵巢癌高风险。

1.2.3 HE4、CA125的检测 收集所有研究对象术前晨起空腹肘静脉血5 mL，置于无抗凝剂的Eppendorf管中，静置10 min后500×g低温离心15 min，分离血清，置-40 ℃冰箱中保存。采用酶联免疫吸附试验检测HE4，试剂购自美国R&D公司。采用cobas e601电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）检测CA125。

1.2.4 组织样本中CLIC4表达的检测 术中获得的病理组织样本部分用于免疫组化检测，部分用于实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测。组织样本经石蜡包埋切片后，采用免疫组化SP试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）进行检测。主要步骤：将石蜡组织切片、脱蜡、水化，经乙醇梯度洗脱后，采用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）冲洗，将切片组织置于柠檬酸抗原修复液中洗涤，冲洗后加入内源性过氧化物酶，经血清封闭，滴加一抗（兔抗人单克隆CLIC4抗体，稀释浓度为1∶100，美国Santa Cruz公司），加入二抗（山羊抗兔IgG抗体），PBS清洗后，加入二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，然后复染、分化、脱水、透明，中性树胶封片。细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为CLIC4阳性。根据细胞染色强度及阳性细胞所占比例进行半定量分析：阳性细胞所占比例<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；根据细胞着色深浅进行评分，未染色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；综合2项评分，0～1分判定为阴性（-）、1～4分为弱阳性（+）、5～8分为阳性（++）、9～12分为强阳性（+++）；将阴性和弱阳性定义为低表达，阳性和强阳性定义为高表达。计算CLIC4阳性细胞染色率：在CX31型电子显微镜（日本奥林巴斯公司）下观察每个切面内2 000个以上的细胞，计算阳性细胞染色百分率，采用Image Pro Plus病理图像分析软件（美国MEDIA CYBERNETICS图像技术公司）对免疫组化染色切片进行分析，计算染色阳性细胞数。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测SNHG3的表达 采用PrimeScript RT Ⅱ逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）提取组织样本中的总RNA，并逆转录成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。检测仪器为SimpliAmp PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司）。PCR反应体系：总体积为20 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL，双蒸水0.6 μL，Rox-Dye 0.4 μL。引物序列：SNHG3上游引物为5'-GTCAGCTACATCTTCATTCACTAC-3'、下游引物为5'-AGTGTCAGTTTAAGGTTACGC-3'；内参基因β-actin上游引物为5'-TGCAAACCTGTCCGGCAGCTGTTA-3'、下游引物为5'-GCCCTAAAGTCGTGACCAGC-3'。PCR扩增条件：95 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；40个循环。对每个循环后的SYBR Green进行荧光信号检查，采用熔解曲线监测扩增产物纯度。重复检测3次，每次设置3个复孔。ΔΔCt=ΔCt卵巢癌组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。将卵巢癌组织中SNHG3相对表达量的中位数作为临界值，分为高表达组和低表达组。

1.2.6 随访 采用电话、门诊复诊等方式对113例卵巢癌患者进行随访。收集患者预后生存及生活质量情况。随访截止时间为2019年4月30日，随访中位时间为39个月，随访至患者死亡或到随访截止时间为止。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件及Excel 2010软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用两独立样本t检验或非配对t检验。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）（范围）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线分析CLIC4、SNHG3对卵巢癌预后的影响，比较采用Log-rank检验。采用Cox比例回归分析评估Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌预后的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组与对照组一般资料的比较

卵巢癌组CA125、HE4、ROMA指数与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.001），年龄、BMI和经产次数2个组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 卵巢癌组与对照组一般临床资料比较

2.2 卵巢癌组与对照组组织中CLIC4表达的比较

免疫组化结果显示，卵巢癌组CLIC4阳性的高表达率及CLIC4免疫组化积分百分率显著高于对照组（P<0.001）。见图1、表2。

表2 卵巢癌组和对照组CLIC4表达情况比较

图1 卵巢癌组与对照组免疫组化检测结果

2.3 卵巢癌组与对照组组织样本中SNHG3相对表达量的比较

卵巢癌组SNHG3的相对表达量为0.726±0.097，显著高于对照组（0.325±0.062）（P<0.001）。见图2。

图2 卵巢癌组与对照组组织样本中SNHG3相对表达量的比较

2.4 CLIC4、SNHG3表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者临床病理特征之间的关系

CLIC4高表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的病理类型（浆液性癌）、组织学分级（G2～G3级）、临床分期（Ⅱ期）有关（P<0.05）。进一步分析不同病理类型患者之间CLIC4表达的差异，结果显示，浆液性癌患者、黏液性癌患者与子宫内膜样癌患者CLIC4表达差异有统计学意义（χ2值分别为16.878、15.990，P=0.000），其他病理类型之间差异均无统计学意义（P>0.05）。根据SNHG3相对表达量的中位数（0.657）将卵巢癌患者分为高表达（SNHG3>0.657）和低表达（SNHG3≤0.657），结果显示SNHG3高表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的组织学分级、临床分期有关（P<0.05）。见表3。

表3 CLIC4、SNHG3表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者临床病理特征之间的关系

2.5 CLIC4、SNHG3表达与患者预后的关系

随访结果显示，113例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年内有30例（26.55%）复发、13例（11.50%）死亡。CLIC4高表达组总体生存率（overall survival rate，OS）、疾病无进展生存率（disease progression-free survival rate，PFS）均低于CLIC4低表达组（Log-rankχ2值分别为5.108、6.541，P<0.05）。SNHG3高表达组OS、PFS均低于SNHG3低表达组（Log-rankχ2值分别为5.467、6.626，P<0.05）。见图3。

图3 CLIC4、SNHG3对Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后影响的Kaplan-Meier曲线

2.6 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌预后影响因素的分析

Cox比例回归分析结果显示，CA125、HE4、CLIC4、SNHG3、组织学分级、临床分期均是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后（生存）的影响因素。见表4。

表4 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后（生存）的影响因素

3 讨论

有研究结果显示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年生存率明显高于晚期卵巢癌患者[7]。因此，对于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的研究热点多集中于寻找灵敏、便捷、创伤性小的生物学指标，以提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的诊断效率。目前，研究较多的生物学指标有CA125、HE4、巨噬细胞迁移抑制因子等，其中CA125是辅助诊断卵巢癌最常用的指标，但CA125存在一定比例的假阳性，且敏感性较低，因此其作为早期卵巢癌的诊断标志物存在一定的局限性[8-11]。CLIC4是细胞内的一种氯通道，主要调节细胞内pH值和细胞体积的变化。CLIC4在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌中呈高表达，而在正常组织中几乎不表达；CLIC4的表达强度与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移等呈正相关[12]。SINGHA等[13]的研究结果显示，CLIC4对早期或低分级卵巢癌的诊断具有更高的价值，诊断效能明显优于CA125。CLIC4高表达可促进卵巢癌组织中的纤维母细胞向肌纤维母细胞转化[14]。目前，国内关于CLIC4与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者临床病理特征之间的关系以及CLIC4在卵巢癌预后评估中的作用的研究较少。为此，本研究探讨了CLIC4在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌中的价值。结果显示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者组织中CLIC4的表达量显著高于良性卵巢囊肿患者（P<0.001）。随访结果也显示，CLIC4是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后的影响因素（RR=2.797，95%可信区间为1.308～7.224）。

肿瘤组织中存在异常表达的lncRNA，在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡过程发挥作用，提示部分lncRNA或可作为肿瘤诊断的潜在的生物标志物[15]。SNHG3是大肠埃希菌U17菌株的宿主基因，位于1号染色体短臂3区6号带。有研究结果显示，SNHG3与肝癌、神经胶质细胞瘤等恶性肿瘤的预后显著相关[16-17]。有研究结果显示，卵巢癌组织中SNHG3呈高表达，较高的SNHG3表达量预示着卵巢癌患者预后不良[18]。本研究结果显示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者组织中SNHG3的相对表达量显著高于良性卵巢囊肿患者（P<0.001），且SNHG3表达与卵巢癌的临床分期、组织学分级等有关，提示SNHG3对Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌病情的判断有一定价值。

本研究结果显示，浆液性卵巢癌患者组织样本中CLIC4表达阳性率明显高于其他病理类型（P=0.000），但预后分析并未发现病理类型是卵巢癌患者预后的影响因素，这可能与浆液性卵巢癌是卵巢癌中最为常见的病理类型有关。本研究结果还显示，组织学分级G2～G3级、临床分期Ⅱ期的卵巢癌患者组织中CLIC4、SNHG3表达均分别高于G1级、临床分期Ⅰ期（P<0.05），且组织学分级及临床分期是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后的影响因素（RR分别为2.886、2.032，95%可信区间分别为1.373～8.005、1.199～7.522）。

本研究尚存在一定的不足之处：（1）未将CLIC4、SNHG3与HE4、CA125等传统指标进行比较，后续研究将进一步探讨CLIC4、SNHG3及HE4、CA125等传统指标与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌临床病理特征及预后的关系；（2）本研究获的样本主要为卵巢癌组织，因此不利于临床诊断，后续将探讨在一些更易获取的样本，如外周血样本中，CLIC4、SNHG3是否具有与组织样本一样的临床价值，以提高诊断的便捷性与灵敏度。

综上所述，CLIC4、SNHG3高表达与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的临床病理特征、预后均显著相关。CLIC4、SNHG3是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者预后（生存）的影响因素。