南瓜炭疽病菌Colletotrichum brevis porum生物学特性及药剂防治

张琳　彭琳　邵郅伟等

中图分类号：S 436. 429 文献标识码：A DOI：10.16688/j. zwbh. 2020115

南瓜Cucurbita moschata是一种富含β-胡萝卜素和抗衰老物质的健康食物，并且南瓜在结籽期会产生丰富的矿物质，比如锌。南瓜原产墨西哥到中美洲一带，明代传入我国，现南北各地广泛种植。炭疽病是南瓜上的一种重要病害，主要发生在南瓜的叶、茎、花等部位，造成烂叶、烂果或死苗，造成严重的经济损失。

以前，普遍认为Colletotrichum orbiculare是引起瓜类炭疽病的病原菌，且在黄瓜、西瓜、长瓜、蜜瓜和苦瓜上均发现该种炭疽病菌的危害。2015年，在‘绿皮香栗23号南瓜上，发现了与之不同的炭疽病菌Colletotrichum brevisporum。本試验对该病原菌生物学特性进行研究，并对13种杀菌剂进行室内毒力测定，以期为该种瓜类炭疽病的预防和治疗提供理论与实践依据。

1材料与方法

1.1供试菌株

南瓜炭疽病菌C.brevisporum（菌株编号为CCCM12）来源于吉林农业大学植物病理综合治理实验室菌种库，病原菌以菌丝体的形式存于干燥滤纸片上，滤纸片置于灭菌硫酸纸袋内保持密封和干燥，保存于-20℃。

1.2供试培养基

生物学特性测定所用培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），配方为马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20g;查氏培养基，配方为氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，硝酸钠2g，硫酸铁0.01g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖30g，琼脂20g，均用蒸馏水补足至1000mL备用。SNA培养基，配方为硝酸钾0.1g，磷酸二氢钾1.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，蔗糖0.2g，葡萄糖0.2g，琼脂15g，蒸馏水补足至1000mL备用。

1.3试剂及仪器

试验采用日本TaKaRa公司生产的10 mmol/LdNTPs、Taq酶、PCR Buffer等;生工生物工程（上海）股份有限公司生产的25mmol/L MgCl₂;其他试剂均为国产分析纯。试验中使用的仪器为日本HITACHI公司生产的CT15RE台式微量高速离心机;基恩士（中国）有限公司生产的超景深三维显微系统VHX-600;美国BI0-RAD公司生产的C1000Touch Thermal cycler PCR扩增仪。

1.4病原菌生物学特性测定

1.4.1病原菌寄主范围测定

利用针刺接种法，供试南瓜炭疽病菌CCCM12在PDA上培养7d，用灭菌的8mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，选用储藏期新鲜南瓜、辣椒Capsicum annuum、紫甘蓝Brassica oleracea、火龙果Hylocereus undatus、西葫芦Cucurbita pepo、青椒Capsicum annuum、黑布林Prunus salicina、红布林Prunus salicina、大白菜Brassica rapa pekinen-sis、木瓜Chaenomeles sinensis、西瓜Citrullus lana-tus、甜瓜Cucumis melo、黄瓜Cucumis sativs和芒果Mangifera indica等14种供试植物进行致病性测定。利用无菌针头刺伤植物果实表面，取直径为8mm的菌饼接种，在同一个植物组织的一半接种CCCM12菌饼，另一半接种空白PDA作为对照。每处理接种5个植物组织，3次重复，接种7d后观察发病情况。

1.4.2病原菌菌丝致死温度的测定

将直径为8mm的南瓜炭疽病菌CCCM12菌株菌饼接至无菌试管中，加入2 mL灭菌水，置于35、40、45、50、55、60℃的水浴中加热10 min，然后接种于PDA平板中央，25℃光照培养，5d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.4.3温度对病原菌生长的影响

用打孔器打取直径8mm的菌饼，接至PDA平板中央，分别在5、10、15、20、25、30、35、40℃的恒温条件下培养，观察菌丝生长情况，并在5d后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.4.4光照对病原菌生长的影响

将直径为8mm的病原菌菌饼接至PDA平板中央，将平板分别置于连续光照、12 h光暗交替、连续黑暗的人工气候培养箱中，25℃恒温培养，5d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.4.5 pH对病原菌生长的影响

用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节PDA培养基的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，向上述不同pH平板（15mL/皿）中移入菌饼（直径8mm），25℃C恒温培养。5d后，十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.4.6碳源对病原菌生长的影响

以查氏培养基为基础培养基，分别用含等质量碳元素的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油和甘露醇作为碳源，以不加碳源的查氏培养基为对照（CK），每皿定量15mL培养基。待培养基凝固后，将直径8mm的菌饼接至含不同碳源的平板上，25℃条件下培养5d后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.4.7氮源对病原菌生长的影响

以查氏培养基为基础培养基，分别用含等质量氮元素的蛋白胨、牛肉膏、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、DL-甲硫氨酸、赖氨酸、硝酸钾和硝酸铵作为氮源，以不加氮源的查氏培养基为对照（CK），每皿定量15mL培养基。待培养基凝固后，将直径为8mm菌饼接至含不同氮源的平板上，25℃条件下培养5d后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理接种5皿，每处理3次重复。

1.5药剂室内毒力测定

1.5.1供试菌株及药剂

供试菌株为南瓜炭疽病菌CCCM12。供试药剂共13种，均为原药：97%醚菌酯，京博农化科技有限公司;95%氟环唑，沈阳科创化学品有限公司;95%腈菌唑、98%抑霉唑和96%咯菌腈，浙江禾本科技股份有限公司;95%福美双，河北冠龙农化有限公司;96%甲基硫菌灵，江苏蓝丰生物化工股份有限公司;99. 6%吡唑嘧菌酯，巴斯夫欧洲公司;95%苯醚甲环唑和95%百菌清，利民化工有限责任公司;98.3%戊唑醇，江苏龙灯化学有限公司;97%多菌灵，江苏辉丰生物农业股份有限公司;95%己唑醇，江苏莱科化学有限公司。其中，咯菌腈、醚菌酯和吡唑嘧菌酯原药用乙腈溶解，其余药剂原药用丙酮溶解，均配制成质量浓度为1×10⁵mg/L的母液保存，用于室内毒力测定。

1.5.2試验方法

采用菌丝生长速率法测定13种供试药剂对南瓜炭疽病菌CCCM12菌丝生长的抑制活性。将预先配制好的药剂母液用0. 1%的Tween-80水溶液稀释后，各浓度梯度的药液以1：9（V/V）的体积比与溶化的PDA培养基混匀，制成不同浓度药剂的PDA平板。根据预试验结果设置6个复筛浓度（表1），以加入等量Tween-80水溶液的PDA平板为空白对照，以加入溶剂的Tween-80水溶液的PDA平板为溶剂对照。将直径为8mm的菌饼接种到含药平板中央，每个处理接种5皿，置于25℃恒温培养箱培养7d，用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算相对抑制率。

相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.6数据分析

利用（Xfice 2010对数据进行整理，结合DPS数据处理系统统计软件求出抑制中浓度（EC₅₀）、置信区间等，比较不同杀菌剂对南瓜炭疽病菌的抑制作用。利用Duncan氏新复极差法进行处理间差异显著性分析。

2结果与分析

2.1南瓜炭疽病菌CCCM12生物学特性测定

2.1.1寄主范围测定结果

将南瓜炭疽病菌CCCM12采用针刺接种方法接种不同植物组织，7d后调查发现，炭疽菌CCCM12菌株对南瓜、辣椒、紫甘蓝、火龙果、西瓜、香瓜、西葫芦、青椒、黑布林、红布林、大白菜、木瓜、黄瓜和芒果均有致病性（表2、图1）。

2.1.2温度对病原菌生长的影响

温度对南瓜炭疽病菌CCCM12生长的影响显著。菌丝在20～30℃生长较好，其中25℃菌丝生长最快，生长5d后的菌落直径为59.5mm; 5℃时，菌株CCCM12在第2天开始生长，且生长缓慢，生长5d后的菌落直径为18.5mm。

2.1.3光照对病原菌菌丝生长的影响

光照对南瓜炭疽病菌CCCM12菌丝生长影响显著。南瓜炭疽病菌CCCM12在12h光暗交替条件下生长较好，在连续光照、连续黑暗、12 h光暗交替条件下培养5d，菌落平均直径分别为55、62、65 mm（表3）。

2.1.4 pH对病原菌菌丝生长的影响

测量菌落直径，不同pH条件对南瓜炭疽病菌CCCM12菌丝的生长影响显著。南瓜炭疽病菌CCCM12菌丝生长适宜pH为6～9，菌落直径范围为54～61mm。最适pH=9，病原菌菌落直径达到61. 67 mm（图3）。pH为10～12，或pH=3，菌落直径<42mm。

2.1.5病原菌菌丝致死温度的测定

使用不同温度的水浴处理南瓜炭疽病菌CCCM12的菌饼，结果表明，菌饼在35～45℃水浴处理10 min后，置于PDA平板上培养，5d后均可长出新的菌丝，而经50、55、60'C处理下，培养10 d后仍未观察到菌丝生长，由此可知南瓜炭疽病菌CCCM12菌丝的致死温度为sooc、10min。

2.1.6碳氮源对病原菌菌丝生长的影响

南瓜炭疽病菌CCCM12在7种不同碳源和9种不同氮源的培养基质条件下都能够生长，但对不同碳、氮源的利用程度不同。在不同碳源中，病原菌对可溶性淀粉的利用效果最好，培养5d后菌落直径为5. 17cm，显著大于其他碳源处理，其次是甘油和葡萄糖，而对甘露醇、蔗糖、果糖和麦芽糖利用效果差。不同氮源中，菌株CCCM12对L-胱氨酸的利用效率最高，培养5d后的菌落直径为2. 73cm，显著大于其他氮源处理，其次为牛肉膏和DL甲硫氨酸，对硝酸铵利用效果较差，而对L-精氨酸利用效果最差，生长缓慢（表4）。

2.2杀菌剂对南瓜炭疽病菌CCCM12的抑制活性

室内生物活性测定表明（图4和表5），南瓜炭疽病菌CCCM12对供试杀菌剂均有一定的敏感性，13种药剂中，福美双和百菌清对南瓜炭疽病菌的抑制效果较差，其EC50均大于20μg/mL（表5）。腈菌唑、己唑醇和吡唑醚菌酯对南瓜炭疽病菌的抑制效果一般，而多菌灵、抑霉唑、甲基硫菌灵毒力较高，EC₅₀分别为0.060 2、0.186 2、0.339 6μg/mL。

3讨论

国内外关于南瓜炭疽病菌研究的报道较少。人们普遍认为Colletotrichum orbiculare是引起瓜类炭疽病的主要病原菌，寄主植物为西瓜、甜瓜和黄瓜等葫芦科植物。而青皮南瓜作为C.brevispo-rum的寄主植物在2018年首次报道以来，其生物学特性及其药剂防治研究尚未进行。

在寄主范围测定中，C.brevisporum除了可使葫芦科南瓜、西葫芦、西瓜、甜瓜等植物致病，也可使十字花科辣椒、紫甘蓝、青椒、大白菜等植物，仙人掌科火龙果，蔷薇科黑布林、红布林致病，寄主范围较广泛。在炭疽菌属中，C.gloeosporioides的寄主范围广泛，是引起多种经济作物炭疽病的病原菌，如芒果、枸杞、大枣和人参等的炭疽病，该种引起的病害一旦发生，防治特别困难，而C.brevisporum是与之完全不同的另一寄主范围较广泛的种，为了预防C brevisporum在田间暴发，本试验开展其生物学特性和室内药剂筛选研究。研究表明，C.brevisporum的菌丝生长适宜pH为6～9，最适pH=9;光暗交替利于菌丝生长;适宜温度20～30℃;致死温度50℃，10 min;适宜菌丝生长的最佳碳、氮源分别为可溶性淀粉和L-胱氨酸。采用菌丝生长速率法测定了13种杀菌剂对其的室内毒力，发现供试药剂中效果较好的为多菌灵、抑霉唑和甲基硫菌灵。目前，南瓜炭疽病的发生范围逐年扩大，而筛选合适的化学农药迫在眉睫。本研究可为合理选择田间化学农药及合适的施用浓度提供依据，并为今后研究该病的抗药性机制提供理论依据。