成都市洒金珊瑚炭疽病病原鉴定及潜在侵染源初探

李翰文　刘欢欢　张敏等

中图分类号：S 432.44 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020114

洒金珊瑚Aucuba jaPonica又名东瀛珊瑚，为桃叶珊瑚属Aucuba常绿丛生灌木，分布于长江中下游地区，适应性强，具备耐寒耐旱特性。在当前园林绿化中被广泛应用，逐渐成为城市的主要绿化植物。关于洒金珊瑚的病害，国外相继报道过炭疽病、根腐病、白粉病等。而在我国，洒金珊瑚移栽后炭疽病的发病率较高，危害较为严重，已成为洒金珊瑚种植过程中的主要病害。炭疽病由炭疽菌属Colletotrichum真菌引起，许多炭疽菌存在复合种群，包含很多生物学上的种，目前国外可见壳皮炭疽菌C.crassipes、胶孢炭疽菌C.gloeos-porioides和黑线炭疽菌C.dematium引起洒金珊瑚炭疽病的记录，国内仅见I。i等12]通过构建多基因系统发育树的方法，将洒金珊瑚炭疽病的病原菌鉴定为果生炭疽菌C.fructicola。炭疽病普遍存在一病多菌的现象，即一种植物可被几种炭疽菌侵染，因此洒金珊瑚炭疽病的病原菌还有待进一步确定。笔者从四川成都的6块样地，采集疑似洒金珊瑚炭疽病的病叶，对病原菌进行分离纯化和致病性测定，通过形态学特征和多基因系统发育树的构建明确洒金珊瑚炭疽病的病原菌种类。

近年来成都市园林植物炭疽病普遍发生，由于洒金珊瑚常与其他园林植物搭配种植，周围搭配种植的植物如果发生炭疽病，是否会成为洒金珊瑚炭疽病的潜在侵染源目前尚未见报道，笔者将在成都市园林植物上分离获得的炭疽病病原菌，接种于洒金珊瑚上，若能产生病斑则有可能成为洒金珊瑚炭疽病的潜在侵染源。明确洒金珊瑚炭疽病病原菌种类及潜在侵染源，可为该病的诊断及科学防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试植物及病原菌：2017年6月至2018年7月从四川省成都市温江区、武侯区、成华区、青羊区、金牛区及锦江区采集疑似为炭疽病的洒金珊瑚病叶。健康洒金珊瑚植株，购自四川省成都市温江区随缘花厂。潜在侵染源测定的21株炭疽菌分离自四川省常种植于洒金珊瑚附近的16种园林植物，均由四川农业大学植物保护实验室提供。

1.2方法

1.2.1病原菌分离纯化

采用组织分离法对病原菌进行分离，所得菌株用挑针转移法进行单孢纯化，纯化好的菌株于4℃冰箱保存备用。

1.2.2致病性测定

取健康洒金珊瑚叶片，无菌水清洗，用脱脂棉蘸取75%乙醇清洗表面，无菌水清洗3次后自然晾干。每张叶片用记号笔均匀分为四部分，每部分中心处用灭菌的梅花针刺伤叶片。处理组在叶片伤口处接种直径5 mm的菌丝圆片，对照组在伤口处接种同样大小的无菌PDA圆片。处理组及对照组各接种5片叶，每片叶接种4处，重复3次。处理组及对照组均置于25℃恒温培养箱内保湿培养，观察记录发病情况。若对照组不发病，处理组发病且症状与田间症状相似，取发病部位进行再分离，完成柯赫氏法则的验证。

1.2.3形态学观察

观察记录单孢菌株菌落形态及菌丝生长速率，挑取分生孢子制片，在显微镜下观察分生孢子特征，并随机选取100个分生孢子测量大小并显微拍照，参考相关资料从形态上进行初步鉴定。

参考Yang等的方法诱导产生分生孢子附着胞，参考Cai等的方法诱导产生菌丝附着胞。在25℃黑暗条件下，分生孢子附着胞培养24 h，菌丝附着胞培养7d，观察附着胞形态并显微拍照，随机选取50个测量大小。

1.2.4多基因系统发育树的构建

收集待测菌株的菌丝体，采用生工生物工程股份有限公司（上海）Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒标准抽提步骤，提取菌丝DNA。采用核糖体内转录间隔区序列（rDNA internal transcribed spacer，ITS）、肌动蛋白基因（actin gene，ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）几丁质合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）、钙调蛋白基因（calmodulin gene，CAL）的引物對病原菌DNA进行扩增。引物由生工合成。25.0μL反应体系参考杨友联等方法。PCR产物由生工测序。各个基因所得序列与GenBank中的序列比对后，结合峰图进行手动修改。在GenBank中下载与所测得序列相似性较高的序列及模式菌株序列。用ClustalX 1.81剪切后，按顺序首尾相连，以甘薯黑痣病菌Monilochaetes infuscans （CBS869. 96）为外群，用PAUP v4. ob10软件以最大简约法（MP）构建系统发育树，建树所用菌株及登录号见表1。

1.2.5洒金珊瑚炭疽病潜在侵染源的测定

将在成都市园林植物上分离获得的炭疽病菌（表4）活化后采用1.2.2的方法，接种于洒金珊瑚上，若能产生病斑则有可能成为洒金珊瑚炭疽病的潜在侵染源。接种10 d后，统计发病率，并根据病斑直径对致病性强弱进行记录。如无病斑产生，则无致病性，记为“”;病斑直径≤5 mm，致病性较弱，计为“+”;5mm<病斑直径<10 mm，致病性中等，计为“++”;病斑直径≥10 mm，致病性较强，计为“+++”。

发病率=（接种后发病叶片数/接种总叶片数）×100%。

2结果与分析

2.1洒金珊瑚炭疽病病原菌的鉴定

2.1.1病原菌的分离培养

从6个采样地分离出38株疑似为炭疽菌的菌株，单孢纯化后根据菌落特征和孢子形态，得到22个代表菌株（表2）。

2.1.2致病性测定

将22个单孢菌株活化后回接到健康的洒金珊瑚叶片上，结果表明，接种10 d后，对照叶片均未发病（图1a），接种叶片全部发病（图lb），症状均与自然发病的相似（图1c）。从人工接种后发病叶片中分离病原菌，所得病原菌与原接种菌株特征一致，证明接种菌株均为洒金珊瑚炭疽病的致病菌。

2.1.3形态学观察

单孢纯化后的菌株，根据菌落形态大致分为6类（图2）。第1类（SJSH8）菌落正面灰黑色，气生菌丝棉絮状（圖2第1类a），背面灰黑色，具有轮纹（图2第1类b）。第2类（ SJSH10）菌落正面中间黑色，边缘白色，气生菌丝致密，有较多橘红色的孢子堆（图2第2类a），背面中间黑色，边缘白色，有明显轮纹（图2第2类b）。第3类（SJSH22）菌落正面白色，气生菌丝稀疏（图2第3类a），背面白色，散生黑色颗粒（图2第3类b）。第4类（ SJSH1、SJSH9、SJSH11、SJSH14、SJSH16、SJSH17）菌落正面白色，气生菌丝较多（图2第4类a），背面浅橘色（图2第4类b）。第5类（ SJSH2、SJSH3、SJSH5、SJSH6、SJSH7、SJSH12、SJSH15、SJSH19和SJSH21）菌落正面白色，气生菌丝多（图2第5类a），背面浅灰色（图2第5类b）。第6类（SJSH4、SJSH13、SJSH18、SJSH20）菌落正面白色，气生菌丝稀疏（图2第6类a），背面白色，具有轮纹（图2第6类b）。各菌株菌丝生长速率见表3。

在显微镜下观察分生孢子形态（图2c），第1、4、5、6类为圆柱形，一端钝圆，另一端钝圆或稍尖;第2类为椭圆形，较短，两端钝圆;第3类为椭圆形，较宽，一端钝圆，另一端略尖。分生孢子附着胞（图2d）第1、2类为深褐色，椭圆形或不规则形，边缘平滑或不规则;第3类为深褐色，近球形，边缘平滑;第4、5、6类为浅褐色至深褐色，近球形，边缘平滑。菌丝附着胞（图2e）第1类为深褐色，椭圆形，边缘平滑;第2、5、6类为浅褐色至深褐色，椭圆形或不规则形，边缘平滑或不规则;第3类为深褐色，不规则形;第4类为深褐色，近球形，边缘平滑。各菌株分生孢子、分生孢子附着胞及菌丝附着胞大小见表3。

2.1.4多基因系统发育树构建

以甘薯黑痣病菌为外群构建多基因系统发育树，树长TL=1230，一致性指数CI=0. 8805，保留指数RI=0.9243，校正一致性指数RC=0. 8138。从发育树（图3）可以看出，第1类菌株（1株）与果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成明显分支;第2类菌株（1株）与隐秘炭疽菌C.aenigma聚在一起，形成明显分支;第3类菌株（1株）与喀斯特炭疽菌C.karstii聚在一起，形成明显分支;第4、5、6类菌株（19株）与暹罗炭疽菌C.siamense聚在一起，形成明显分支。其他参与分析的炭疽菌与相应的种聚在一起，形成明显的分支，且每个分支的支持率均较高。结合形态学特征，将第1类菌株鉴定为果生炭疽菌C.fructicola Prihastuti，L.Cai&K.D. Hyde，第2类菌株鉴定为隐秘炭疽菌C.aenigma B.Weir&P.R.Johnst，第3类菌株鉴定为喀斯特炭疽菌C.karstii Y.L.Yang，Zuo Y.Liu，K.D.Hyde&L. Cai，第4、5、6类菌株鉴定为暹罗炭疽菌C.Siamense Prihastuti，L.Cai&K.D.Hyde。

2.2洒金珊瑚炭疽病潜在侵染源测定

将其他园林植物上分离的炭疽病菌接种洒金珊瑚，除对照未发病外，其余菌株在人工接种条件下均能不同程度地引起洒金珊瑚发病，并表现出强弱不同的致病性，具体测定结果见表4。

3讨论

来自于温江区、武侯区、成华区、青羊区、金牛区、锦江区的22株炭疽菌单孢菌株，隶属于暹罗炭疽菌、隐秘炭疽菌、喀斯特炭疽菌和果生炭疽菌4个种，其中暹罗炭疽菌有19株，占总分离菌株的86.4%，且除成华区外其余5个区均分离到暹罗炭疽菌，暹罗炭疽菌应为洒金珊瑚炭疽病的优势致病菌。进一步验证了一种植物可被几种炭疽菌所侵染。其中果生炭疽菌引起洒金珊瑚炭疽病的结果与Li等的结果相同。暹罗炭疽菌、隐秘炭疽菌及喀斯特炭疽菌引起洒金珊瑚炭疽病为首次报道。

根据菌落形态划分的部分类型与基于多基因系统发育树鉴定的炭疽菌的种基本吻合，但暹罗炭疽菌存在3类不同的菌落形态，因而在试验中不能根据菌落形态对菌株种类进行判定。喀斯特炭疽菌分生孢子的长和宽均与暹罗炭疽菌、果生炭疽菌和隐秘炭疽菌有明显区别，其分生孢子附着胞在宽度上与其他种的分生孢子附着胞也具有明显区别。因此分生孢子和分生孢子附着胞可作为鉴别炭疽菌的参考依据，但暹罗炭疽菌、果生炭疽菌和隐秘炭疽菌的分生孢子和分生孢子附着胞在长和宽上具有一定的相似度，很难相互区分。加上很多复合种内甚至不同复合种的炭疽菌常具有相似的形态特征，若想将炭疽菌准确鉴定到种，还需要结合多基因系统发育树分析进一步鉴定。

本文中从其他园林植物上分离所得的21株炭疽菌，在人工接种条件下均可以引起洒金珊瑚发病，这些病原菌都可能成为洒金珊瑚炭疽病的潜在侵染源。在园林绿化中，为增加美观度，普遍是多种植物搭配种植。在自然条件下病原菌很容易在多种不同植物间交互传播，加重炭疽病的发生。因此在园林绿化中对炭疽病进行防治时，应对区域内所有植物统筹制定防治措施，本试验研究结果可为园林绿化中炭疽病的防治奠定基础。