进境澳大利亚大麦夹杂油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定

张慧丽　李雪莲　陈先锋等

中图分类号：S 41-32 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh. 2020106

油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculan3于2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，是一种检疫性真菌。目前，在北美洲的加拿大和墨西哥，南美洲的巴西，大洋洲的澳大利亚，欧洲的英国、法国、德国等国家均有分布，但在中国、日本、韩国和俄罗斯等国家还未见发生危害的报道口]。导致加拿大、澳大利亚和欧洲地区油菜籽产量和质量损失的主要原因就是油菜茎基溃疡病的发生，一般年份可导致产量损失10%～20%，严重时产量损失可达30%～50%，甚至更高。油菜茎基溃疡病菌在全世界导致的油菜每个生长季的损失超过9亿美元。目前，我国口岸检疫部门已经从澳大利亚、乌克兰、加拿大等进境的油菜籽，新西兰进口的十字花科蔬菜种子中多次检出该病菌，病菌传人的风险不断加剧。中国是油菜的起源地之一，油菜种植在我国已有上千年历史，是我国种植面积最大的油料作物，也是国产植物油第一大油源，第二大饲用蛋白源。Fitt等用模拟模型预测了我国南方（长江流域）油菜种植区油菜茎基溃疡病传人后16年的流行趋势，仅长江流域每年平均损失达4. 93亿美元，同时还会对我国的十字花科野生植物构成重大威胁。

油菜黑胫病（black leg of oilseed rape）是油菜上最严重的真菌病害之一，引起该病害的病原至少有两种：L.maculans和L.biglobosa。因检疫工作的需要，L.biglobosa在油菜上引起的病害被称为油菜黑胫病（black leg），L.maculans引起病害称为油菜茎基溃疡病（phoma stem canker）。油菜莖基溃疡病菌危害油菜茎基部，致病力强，危害重，是引起油菜产量损失的主要因素，迄今该病菌在我国未见分布。油菜黑胫病菌致病性弱，引起茎中上部发病，在我国已有发生报道。这两种病菌都属于真菌界Fungi、子囊菌门Ascomycota、格孢腔菌目Pleosporales、小球腔菌科Leptosphaeriaceae、小球腔菌属Leptosphaeria。目前，根据rDNA基因间隔序列（ITS）、β-tubulin（ TUB）和actin（ACT）序列分析，油菜茎基溃疡病菌种下包括2个亚种，分别是：L.maculans subsp.brassicae（寄主为芸薹属Brassica栽培植物）和L.maculans subsp. lepidii（寄主为独行菜属Lepidium植物）。油菜黑胫病菌种下包括6个亚种，分别是：L.biglobsa subsp.brassicae、L.biglobsa subsp. thlaspii、L.biglobosasubsp. erysimii、L.biglobosa subsp. canadensis、L.biglobosa subsp.australiensis和L.biglobsa subsp.occiaustralensis.

油菜茎基溃疡病菌的形态特征受环境、培养基和外部条件影响，变化极大。仅用形态学特征无法鉴定油菜茎基溃疡病菌。由于油菜茎基溃疡病在全球贸易中的重要性，快速、简便地检测油菜茎基溃疡病的发生和发展对控制该病的传播和保证油菜籽的品质至关重要。Mahuku等根据ITS序列设计特异引物HV17S/HV26C，对安大略湖油菜田块油菜茎基溃疡病菌分布进行了调查;Liu等基于ITS序列设计特异性引物，通过产物片段大小来区分L.maculans和L.biglobosa。周国梁等、易建平等和陈青等采用特异性引物扩增结合ITS基因序列分析分别从澳大利亚进口的油菜籽、新西兰的青菜种子中成功检测到油菜茎基溃疡病菌。Fernando等采用Liu等设计的异性引物对加拿大油菜种子和油菜籽黑胫病的感染水平进行了评估。周国梁等根据ITS区序列设计了Taq-Man MGB探针，建立了该病菌的实时荧光PCR检测方法。Song等根据ITS序列设计了2对引物，建立了油菜茎基溃疡病菌巢式PCR检测方法。周圆等根据ITS序列差异，建立了油菜茎基溃疡病菌环介导等温扩增一横向流动试纸快速检测方法。上述检测技术均是建立在ITS序列分析基础之上，表明ITS序列能够有效鉴定划分油菜茎基溃疡病菌。

2019年3月，宁波口岸从一批进境的澳大利亚大麦中发现夹杂有大量油菜籽，挑选形态异常的油菜籽进行分离培养后，获得1株疑似油菜茎基溃疡病菌的分离物，对其进行了致病性测定、形态学观察、基因序列比对分析研究，以期在准确鉴定该分离物种类的基础上，对其危害进行评估，为口岸检疫鉴定、后续疫情防控及相关研究工作奠定基础。

1材料与方法

1.1供试样品

供试油菜籽为2019年3月进境澳大利亚大麦中夹杂的油菜籽。致病性测定用的油菜籽为市售油菜种子。

1.2培养基及主要试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基，含有氯霉素100μg/mL，杭州微生物试剂有限公司，用于病菌分离、纯化和保存。

TANBead Plant DNA Auto Kit，台湾TANBead公司;2×Taq MasterMix，北京康为世纪生物科技有限公司;100 bp DNA Marker，宝生物工程（大连）有限公司;其他试剂均为分析纯;引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3仪器

BX-51型生物显微镜，日本Olympus公司;AxioImager Z1型显微镜数码成像系统、Discovery V12型解剖镜及其成像系统，德国Zeiss公司;Friocell222型培养箱，德国MMM公司;Kingfisher mL核酸自动化提取仪、Multiskan G（）生物分光光度计，美国Thermo Scientific公司;TProfessional Basic型PCR仪，德国Biometra公司;PowerPac Basic型电泳设备和GelDocEQ型凝胶成像系统，美国伯乐生命医学产品有限公司。

1.4病原菌的分离与纯化

从大麦中挑选畸形、变色等外观不正常的油菜籽，采用常规真菌分离方法对油菜籽进行病原菌分离。1%次氯酸钠表面消毒3min，无菌水漂洗3次，在灭菌滤纸上吸干水分后，置于PDA平板培养基上，每皿放10粒，25℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取边缘菌丝进行纯化，纯化后菌株编号为01829。

1.5分离病原菌菌株的致病性测定

选取健康的油菜籽播种于育苗盘中，置于温度25'C左右、日光条件下育苗间培养。分别在长出2片子叶和真叶后采用针刺法进行菌株01829的致病性测定。用70%乙醇擦拭子叶和茎基部进行表面消毒后，用经酒精灯烧过冷却后的0号昆虫针点刺子叶和茎基部，取PDA培养基上培养6d的菌落，用直径5mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼有菌丝面放置在刺伤处，上覆蘸有无菌水的灭菌脱脂棉保湿，接种后置于塑料收纳箱内并扣上盖，25℃室温条件下培养。以接种无菌PDA为对照，每处理3次重复。接种后每天观察并记录发病情况。

1.6分离病原菌菌株的形态观察

将纯化的菌株01829接种于直径9 cm的PDA平板培养基上，25℃黑暗培养14 d后，观察记录其菌落形态特征。将PDA平板上的供试菌，在解剖镜下观察分生孢子器，挑取分生孢子器制片后在显微镜下观察分生孢子器和分生孢子的形态特征，并对其大小进行测量。

1.7分离病原菌菌株的分子生物学研究

1.7.1基因组DNA提取

用灭菌枪头刮取在PDA平板培养基上培养10 d的01829菌丝体，用TANBead Plant DNA Auto Kit在KingFisher mL核酸自动化提取仪上提取病原菌总DNA。提取后DNA经分光光度计测定浓度后，保存于-20℃冰箱备用。

1.7.2特异性引物PCR检测

参照出入境检验检疫行业标准SN/T 3685-2013《油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法》中的PCR方法，采用特异性引物LMRl-D（5′-GCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTC-3′/5′-TCCTGCT-CCTACTCCTTCTCTAGC-3′）和Lmb（5′-CACCAATTGGATCCCCTA-3′/5′-AGGCGAGTCCC-AAGTGGAACA-3′），对菌株01829的总DNA进行PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，用凝胶成像系统观察电泳结果。

1.7.3序列扩增和测序

采用ITS通用引物ITS1/ITS4对菌株01829总DNA进行PCR扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，产物送上海华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.7.4序列分析

测得的ITS序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析，确认序列的可靠性。使用MEGA 6.0软件对测得的ITS序列与GenBank中下载的油菜茎基溃疡病菌及其近似种的ITS序列进行比对，以GenBank上下载的草茎点霉Phoma herbarum的相关序列为外群，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化发育树，进行1000次重抽样诉计算系统树中节点的置信度。

2结果与分析

2.1菌株01829的菌落性状和形态特征

菌落生长速度较慢，边缘不整齐，菌丝呈白色放射状，多而致密，分枝较多，有分隔（图1a～b）。分生孢子器褐色至深褐色，球形至扁球形（图1d），散生、埋生或半埋生于菌丝中，直径133～334μm，挤压后释放大量分生孢子。分生孢子无色透明，椭圆形或纺锤形，两端各见1油球，大小（1. 6～6.8）μm×（0.9～2.1）μm（图1c）。L.biglobosa在PDA培养基上产生黄色色素，菌丝白或微黄;而L.maculans在PDA培养基上无色素产生，菌丝白色，分枝较多;结合孢子大小和文献报道，初步判断菌株01829疑似L.maculans。

2.2菌株01829致病性测定结果

油菜子叶接种01829菌株2d后开始发病，接种点附近出现圆形枯死斑，浅褐色，稍凹陷。对照没有产生上述症状（图2a）。油菜茎基部接种01829菌株4d后在接种点附近出现褐色病斑，病斑不断扩大，在茎基部形成凹陷的溃疡斑（图2b）。对照没有产生上述症状（图2c）。经再次分离培养和ITS序列测定，获得了与01829形态和ITS序列一致的菌株。

2.3菌株01829的特异性引物PCR检测

用油菜茎基溃疡病菌特異性引物对Lmb对分离物01829的DNA进行PCR检测，结果扩增得到了约为270bp的预期扩增产物，无非特异性条带（图3）。特异性引物对LMR1-D扩增得到了约为580 bp的预期扩增产物，但有明显的非特异性条带，这与王振华等的结果有所不同。

2.4菌株01829 ITS序列分析

经引物ITS1/ITS4扩增后获得长度为511 bp的ITS片段，GenBank序列登录号为MT138669。在GenBank中对该序列进行BLAST搜索和比对分析，发现该序列与油菜茎基溃疡病菌（GenBank登录号：DQ458907）ITS序列的相似性为99. 61%;与6个L.maculans subsp. brassicae的ITS序列相似性为99.14%～99. 36%;与1个L.maculans subsp. lepidii的ITS序列相似性为94. 91%。进一步通过ITS系统发育分析发现菌株01829的ITS序列与L.maculanssubsp. brassicae的相关序列聚在同一个分支上（boot strap值为99），而L.maculans subsp.lepidii则位于另一个分支（图4）。序列分析及系统发育分析表明菌株01829为L.maculans subsp. brassicae。

3讨论

油菜茎基溃疡病菌无性态为Phoma lingam，其典型形态特征为产生近球形分生孢子器和分生孢子。本研究中发现，该病菌只有在早期分离培养时，可以在培养基上产生分生孢子器，后期多次转代后则难以产生。油菜茎基溃疡病菌检测技术有分离培养法和PCR方法，PCR以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。Taylor等根据一段重复序列LMR1（5238 bp）设计特异引物LMR1-D，建立了检测油菜茎基溃疡病菌的PCR方法，王振华等利用该方法从加拿大进口油菜籽中检测到油菜茎基溃疡病菌，但是在本研究中，特异性引物对LMR1-D的扩增产物有明显的非特异性条带，通过调整退火温度也未能消除。本研究采用了口岸日常检测工作中使用的行业标准SN/T 3685-2013中提供的2对特异性引物对检测样品进行PCR检测。结果表明，引物对Lmb扩增特异性优于引物对LMR1-D，这一结果为口岸检测人员提供了参考。从基于ITS序列构建的系统发育树上可以看出，L.maculans subsp.brassicae和L.maculans subsp. lepidii各成一个分支，01829与多个不同地理来源（荷兰、加拿大、英国、美国、澳大利亚）的L.maculans subsp. brassi-cae位于同一个分支中，且与多个来自澳大利亚的分离物聚在同一个分支，这与01829来自澳大利亚是一致的。本研究获得分离物为L.maculans subsp.brassicae。除油菜茎基溃疡病菌外，我们也从该批大麦夹杂油菜种子上检出了油菜黑胫病菌L.biglo-b03a，据文献报道这两种病菌在澳大利亚均有分布。为提高检测工作针对性，实际检测工作中可采用PCR方法对油菜籽进行初筛，在此基础上再进行分离培养和鉴定工作。

澳大利亚农业生产是雨养农业，无灌溉设施，作物单产变幅较大，作物轮作模式的研究是澳大利亚农业研究的主要内容。油菜对谷类作物根系病害以及单子叶杂草等有明显的控制效果，是轮作系统中的理想“中断作物”。因此，澳大利亚在同一田块上每4年以上种1次油菜。轮作顺序依次是：豆科牧草——阔叶作物（油菜）——谷类作物（小麦）——阔叶作物（羽扇豆、豌豆等）——谷类作物（大麦）。正是由于生产上集中连片种植和全程机械化，导致油菜籽可能夹杂在澳大利亚出口的各种轮作作物中。据段维军等统计，自从2009年11月上海和江苏口岸首次截获该病菌以来，截止2016年，全国口岸共截获该病菌626次。来源国包括：加拿大、澳大利亚、法国、日本、瑞典、荷兰、美国、乌克兰。货物种类包括：油菜籽、小麦、豌豆、大豆、青菜种子、甘蓝种子等。说明携带这种检疫性病菌的油菜籽通过夹杂在其他作物中进行传播的可能性较高。带菌种子是该病害远距离传播的主要方式，据Hall等和汪国平等的研究，种植油菜种子携带油菜茎基溃疡病菌的频率平均为0. 5%～0.6%，尽管在种植当年损失不足1%～2%，但不斷积累的菌源将对油菜生产构成巨大威胁。因此，在日常检疫中对夹杂的油菜籽必须加以重视。

以往口岸检疫研究多针对进口货物本身，对其中夹杂物的研究较少。但是，进境货物夹杂物中携带多种病菌的可能性很大。近年来，口岸部门已多次从进境大宗粮油货物夹杂物中截获多种检疫性真菌，如：自乌克兰玉米夹杂的向日葵种子中截获向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi;自法国大麦夹杂的向日葵种子中截获大丽轮枝菌Verticilliumdahliae;自美国大豆夹杂的向日葵种子中截获向日葵茎溃疡病菌和向日葵黑茎病菌Plenodomuslindquistii等。这些截获表明：进境大宗粮油货物夹杂物中携带检疫性真菌可能性较高，口岸检疫部门应予以高度关注，加强防范，以防检疫性病原通过这种方式跨境传播。