FGG与FGA在吸烟所致COPD中的表达及意义*

刘宏军， 顾建军， 高君吟， 王玉秀， 闵凌峰

（扬州大学临床医学院，苏北人民医院呼吸与危重症科，江苏扬州，225001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的慢性疾病，持续的呼吸道症状和气流受限是它的主要特征，被认为是来自于各种终生的、动态的和累积的基因-环境相互作用的结果，吸烟是其中最主要的危险因素［1］。它是目前全世界排名前三的死亡原因之一，90%的死亡发生在低收入和中等收入国家［2］。在2015 年，中国20 岁及20 岁以上的COPD 患者总数估计为9 990万，其中相当一部分患者未能得到及时诊断［3］。此外，在许多未达到COPD 肺功能诊断标准的人群中，已经发现了肺部损害，和某些功能的下降［4］。寻找参与COPD 发病机制的生物标志物，将有利于COPD的早期发现、干预和治疗。近年来，高通量测序已广泛用于研究肺部疾病的发病机制［5］，多个COPD 相关的差异基因被发现，由于检测和分析方法的局限性，目前仍不能完全解释COPD 发病原因［6-7］。有人尝试利用多个数据集综合分析，提高可靠性，获得了一定成果［8］。在本研究中，我们利用差异分析方法，鉴定出在多个COPD 相关mRNA 数据集中均差异表达的2 个基因为FGG和FGA，结合不同数据库来源、不同组织样本、不同种属的数据集分析它们的表达特点，结果提示纤维蛋白原γ 链（fibrinogen gamma chain，FGG）和纤维蛋白原α 链（fibrinogen alpha chain，FGA）可能是参与COPD 发病机制的生物标志物。FGG 与FGA 在蛋白水平与mRNA 表达是否一致不得而知，因此我们构建了小鼠吸烟模型进行了验证，具体报告如下。

材 料 和 方 法

1 数据分析

1.1 数据来源 从基因表达数据库（GEO）找到3个人肺组织来源的mRNA 表达数据集GSE57148、GSE47460（测序平台：GPL14550）、GSE76925，人小气道上皮（支气管镜刷检获得）来源数据集GSE5058，小鼠肺组织来源数据集GSE17737。肿瘤基因组图谱数据库（the Cancer Genome Atlas，TCGA）获得病理正常的癌旁肺组织的mRNA表达数据。

1.2 差异基因获取方法 利用R 软件的limma包对GSE57148 表达矩阵数据进行差异基因分析，使用GEO2R 在线分析获得GSE47460（GPL14550 平台）数据集差异基因的.txt文件，显著差异基因标准为|log-FC|＞0.5，adj.P. Val＜0.05，对获得的两组差异基因取交集，在GSE76925 进行GEO2R 在线分析获得的差异基因文件中进行验证。

1.3 GO 分析 在DAVID 网站（6.8）对获得的上调基因及下调差异基因分别做GO 富集分析，以P＜0.05，FDR＜0.01为标准筛选结果。

1.4 基因表达特征分析 选择人肺组织数据集GSE76925、小气道上皮数据集GSE5058、小鼠肺组织数据集GSE17737 和TCGA 病理正常的癌旁肺组织的mRNA 表达数据，在各个表达矩阵中提取FGG 与FGA 的mRNA 表达值，结合各组数据包含的吸烟或COPD状态信息进行特征分析。

2 实验方法

2.1 动物模型构建及样本取材 雄性C57BL/6J 小鼠（8周龄，体重20～25 g）16只购自北京维通利华实验动物中心，许可证号为SCXK（京）2016-0006。随机分配为对照组与吸烟组，每组8 只，采用烟熏法建立小鼠COPD 模型，对照组予新鲜空气，吸烟组在自制染毒箱内以南京牌香烟（焦油量11 mg）烟雾（cigarette smoke，CS）作为刺激物处理30 min，每次使用5支香烟，每天2 次，间隔4 h，每周暴露5 天，连续处理24 周，处理完成后麻醉小鼠行气管插管，0.8 mL 生理盐水冲洗肺部3 次，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），从胸腔取肺，左肺制匀浆离心后冻存上清，右肺行组织切片，4%甲醛固定肺组织24 h后石蜡包埋。所有动物实验方案均经扬州大学研究伦理委员会批准。

2.2 ELISA 采用ELISA 试剂盒，按说明书操作，检测小鼠肺组织及肺泡灌洗液中白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平。

2.3 HE 染色及免疫组化染色 蜡块样本正中矢状面切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗脱二甲苯，苏木紫染色，1%酸性乙醇分化后水洗，伊红染色后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后盖片，观察肺泡间隙扩大情况。蜡块样本正中矢状面切片，以二甲苯脱蜡、乙醇水合、柠檬酸钠高温修复、兔抗小鼠FGG、FGA、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体孵育；山羊抗兔IgG H＆amp;L（HRP）Ⅱ抗在室温下染色20 min，最后DAB 反应显色。所有切片均采用Olympus显微镜拍摄。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学处理，所有实验均独立重复3 次，计量资料使用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采用SNK 法进行事后比较，两组均数间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 筛选差异基因

以adj.P.Val＜0.05 和|logFC|＞0.5 的阈值进行筛选之后，GSE57148 数据集中鉴定出850 个差异基因（上调495 个，下调355 个），GSE47460（GPL14550）鉴定出238 个差异基因（139 个上调，99 个下调）。两组取交集获得共同的COPD 与非COPD 差异基因（上调22 个，下调7 个），在GSE76925 差异基因结果中进行验证，仍然符合adj.P. Val＜0.05 和|logFC|＞0.5 标准的差异基因包括8 个上调的差异基因，分别是FGA、FGG、COL14A1、COMP、NPTX1、TIMP4、GREM1和CYP1B1，及2 个下调差异基因分别是SLITRK6和PRPH。

2 GO分析结果

在DAVID 网站（6.8 版本）对上调基因及下调基因分别做GO 富集分析，选择P＜0.01，FDR＜0.01 为标准，下调基因无阳性结果。上调差异基因GO 分析结果主要包含生物学过程、细胞定位和分子功能3个方面，其中生物学过程结果主要有细胞外基质组织、胶原原纤维组织、凝血，纤维蛋白凝块形成、肽类激素分泌的正调控等；基因主要定位于细胞外间隙、纤维蛋白原复合物、细胞外基质、血小板α 颗粒中；分子功能仅包括一项蛋白质结合、桥接。其中FGA与FGG 以及COL14A1，共同定位于细胞间隙，参与细胞外基质及胶原纤维合成等生物学过程，涉及分子功能是蛋白质结合和桥接。FGA与FGG还共同参与凝血，纤维蛋白凝块形成等其他多个生物学过程。

3FGG与FGA基因表达量与吸烟及COPD的关系

COPD患者肺组织FGG与FGA的表达以及FGG/FGA（FGG 与FGA 表达量的比值）均高于表型正常的吸烟者（P＜0.05），见图1A、B。为分析它们诊断COPD 的价值，对FGG/FGA、FGG 和FGA 分别作ROC曲线分析，FGG/FGA 曲线下面积为0.7315，FGG 与FGA 曲线下面积分别为0.7097 和0.6275，见图1C。吸烟20 包1 年以上者肺组织的FGG 表达与FGG/FGA 高于吸烟20 包1 年以下的低剂量吸烟者，见图1D、E。TCGA 数据显示当前吸烟者肺组织FGG与FGA 表达显著高于非吸烟者，戒烟小于15 年者仍不能完全恢复正常，见图1F。

Figure 1. FGG and FGA expression in the lung were affected by smoking and COPD. A：expression of FGG and FGA in smokers and COPD patients；B：the ratio of FGG to FGA expression in smokers and COPD patients；C：ROC analysis of FGG，FGA and FGG/FGA；D：FGG and FGA expression in the lungs analyzed according to the number of cigarettes packs-year；E：the ratio of FGG to FGA expression in the lungs analyzed according to the number of cigarettes packs-year；F：FGG and FGA expression in pathologically normal lung tissue from patients from TCGA by different smoking status. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs smokers；#P＜0.05vs 0～20 group；△P＜0.05vs non-smokers；△P＜0.05vs current smokers.图1 FGG与FGA表达受吸烟史及COPD疾病的影响

肺组织的FGG 与FGA 水平不受年龄和性别的强烈影响，见图2A、B。小气道上皮来源的数据中，FGG 与FGA 水平在COPD 患者中同样高于表型正常的吸烟者，COPD 组患者FGA 表达水平高于COPD 早期分组，且在COPD 早期分组又高于表型正常吸烟者，见图2C。香烟烟雾处理同样会导致小鼠肺组织FGG与FGA基因表达增高，烟雾处理时间越长，这种趋势越明显，脱毒处理后这种趋势可以部分逆转，见图2D。

Figure 2. Relationship between FGG and FGA expression with age，sex，tissue origin and species. A：FGG and FGA expression in lungs from the GSE76925 by sex；B：FGG and FGA expression in lungs from the GSE76925 by age；C：FGG and FGA expression in human tracheal epithelia；D：FGG and FGA expression in the lungs of mice that were sham-treated or that were exposed to cigarette smoke for different weeks. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs smokers group；#P＜0.05vs early COPD group；△P＜0.05vs sham group；＠P＜0.05vs smoke 12 weeks group；▲P＜0.05vs smoker 24 weeks group.图2 FGG和FGA表达与年龄、性别和组织来源与种属的关系

4 小鼠肺组织与肺泡灌洗液中IL-6水平的变化

经ELISA 试剂盒检测，吸烟组小鼠肺泡灌洗液及肺组织匀浆中，IL-6 水平均高于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 ELISA检测小鼠BALF及肺组织匀浆中IL-6的水平Table 1. Detection of IL-6 in BALF and lung homogenate of the mice by ELISA（ng/L. Mean±SD.n=8）

5 小鼠肺组织HE染色观察

如图3 所见，吸烟组小鼠肺组织可见部分肺泡腔扩大、肺泡间隔断裂、肺泡腔融合形成，而对照组小鼠肺泡结构相对完整。

Figure 3. HE staining of mouse lung tissues. The mice in the 2 groups were treated with air and cigarette smoke，respectively.图3 小鼠肺组织HE染色

6 小鼠肺组织FGG、FGA、α-SMA 与E-cadherin水平的变化

免疫组织化学方法检测小鼠肺组织FGG、FGA、α-SMA与E-cadherin的表达，结果表明香烟烟雾处理可致肺组织中FGG、FGA 和α-SMA 水平升高，E-cadherin 水平下降，FGG 与FGA 主要表达于支气管及肺泡上皮细胞，以肺泡上皮细胞为主，见图4。

讨论

本研究中，我们对GSE57148 与GSE47460 数据集分别进行了差异基因分析后取交集，以上数据集的共同特点是均采用COPD 患者与非COPD 患者的分组方式，均为肺组织标本，每组样本量都大于90。GSE76925是一个以COPD 患者与表型正常吸烟者为分组方式的数据集，将前述结果在该数据集再次进行验证。对最终获得的差异基因进行了GO 分析，显示以上差异基因中FGA与FGG以及COL14A1共同定位于细胞间隙，参与细胞外基质及胶原纤维合成等生物学过程。而细胞外基质重塑是COPD 的重要特征［9］。

COL14A1在肺动脉高压患者的血管内膜中层显著上调，通过稳定胶原纤维增加了血管硬度［10］，COL14A1与COPD的关系尚未见报道。

FGG 与FGA 除参与细胞外基质重塑，还共同参与凝血等多个生物学过程。很多凝血指标，如血浆纤维蛋白原等变化，被证明与COPD 相关［11］。FGA、FGB 和FGG 各自独立编码的3 个多肽链，以链内和链间的二硫键的形式，构成了纤维蛋白原［12］。纤维蛋白原被认为是可行的COPD 标志物，主要用来预测COPD 的不良预后［13］。FGG、FGA、FGB基因均被报道存在多个突变体，可致遗传性纤维蛋白原缺陷［14-15］。

我们选择FGG 与FGA 作为下一步研究对象。通过对GSE76925 数据分析发现，吸烟可致人肺组织FGG与FGA表达增高，戒烟有助于逆转这个情况，但需时较长，TCGA 的数据表明戒烟小于15 年，这种趋势仍不能完全缓解。研究表明，吸烟时间越长、吸烟强度越高，COPD 的风险就会显著增加，戒烟后，与现在的吸烟者相比，曾经吸烟者患COPD 的风险较低［16］，我们的统计结果有助于解释驱动这一现象的内在原因。COPD 患者肺组织FGG/FGA 值高于表型正常吸烟者，辅助诊断COPD的效果甚至要优于FGG或FGA单个基因的表现。此外肺组织FGG 与FGA的mRNA 表达不受年龄和性别的强烈影响，因而具备成为COPD标志物的良好潜力。

在一个小气道上皮来源的数据集中，我们发现FGA 还有助于区分肺一氧化碳弥散量（diffusion capacity for carbon monoxide of lung，DLCO）下降的COPD 早期患者，DLCO 与COPD 的发病和预后显著相关［17］，与肺组织样本的区别在于，小气道上皮样本中FGG 与FGA 表达水平相接近。肺组织FGG 与FGA 的mRNA 表达变化，先于COPD 发生就已出现，这为COPD的早期诊断提供了可能。

吸烟及COPD 状态下，肺组织FGG 与FGA 在蛋白水平是否与mRNA水平一致，尚未得到验证。由于人肺组织获取困难，我们决定以小鼠为研究对象，在来自小鼠的数据集中，我们再次验证了吸烟对小鼠肺FGG 与FGA 表达的影响，与人肺组织中得到的结果是基本一致的。我们以香烟烟雾全身暴露法构建了COPD 模型鼠［18］，HE 染色显示吸烟组小鼠出现肺气肿改变，提示COPD造模成功。免疫组化结果显示吸烟处理可致小鼠肺组织FGG 与FGA 肽链含量增加，FGG与FGA在蛋白质水平与mRNA密切相关。

ELISA 结果显示，吸烟小鼠肺泡灌洗液及肺组织内的IL-6 水平高于对照组，提示吸烟会诱发肺组织炎症，这与已有的研究结果是相符的。A549 细胞被证明在IL-6刺激下能合成纤维蛋白原，相应的3个多肽链表达均增高，但增高的水平不一致，这个过程受糖皮质激素影响［19］，而香烟烟雾提取物刺激可使A549 细胞、单核细胞以及人支气管上皮细胞内IL-6水平升高［20-21］，吸烟或通过诱导肺局部炎症促使肺上皮细胞合成FGG 与FGA 肽链，进而合成纤维蛋白原。金黄色葡萄球菌可通过与纤维蛋白原结合发挥致病作用［22］，这可以部分解释，COPD 患者更高的肺炎发生率和更差的预后［23］。FGG与FGA虽然是合成纤维蛋白原的原料，但我们的研究表明，FGG 与FGA的表达变化并不一致，显然不能与纤维蛋白原变化水平相等同。

FGG 与FGA 除参与合成纤维蛋白原，是否存在其他参与COPD 发生的机制仍是未知领域。已有研究发现，FGG 可以通过激活上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进肝癌细胞迁移和侵袭［24］。FGA基因敲除促进A549 和H1299 细胞的增殖、迁移和侵袭，降低EMT 标志物E-cadherin 和细胞角蛋白5/8的表达［25］。EMT机制深度参与COPD发病过程中的气道重构［26］，小气道重构与肺泡附件丢失是COPD 小气道气流受限的决定性因素［27］，而小气道与肺泡上皮正是FGG 与FGA 的主要表达区域。我们的动物实验结果也显示，吸烟可致小鼠肺组织α-SMA水平升高，E-cadherin水平下降。吸烟可能通过上调IL-6 影响FGG 与FGA 的表达调节肺泡上皮细胞EMT转化，参与COPD的发生。

综上所述，通过生物信息学分析，我们发现FGG与FGA 在肺组织的表达水平与吸烟及COPD 的发生显著相关，FGG/FGA 有助于早期识别COPD，具有成为COPD 标志物的潜力。动物实验证明FGG 与FGA在蛋白水平与mRNA 水平变化一致，吸烟或通过上调IL-6 刺激小鼠肺组织FGG 与FGA 的合成，继而影响EMT 水平参与COPD 的发生。戒烟有助于缓解吸烟引起的肺组织基因表达异常。