HDAC3负性调控mTOR促进低氧诱导H9C2心肌细胞自噬

王月涵，黄 颖

细胞自噬是指在生理或病理条件下，溶酶体降解自身的细胞器或者分子物质的过程。心肌细胞自噬能够促进心室重构，是导致心力衰竭的重要原因之一。但迄今为止，导致心肌细胞自噬的机制尚不明确。组蛋白去乙酰化酶3 (histone deacetylase 3, HDAC3)是表观遗传学调控的重要分子。研究表明HDAC3能够促进心肌细胞肥厚，诱导心功能不全，并和先天性心脏病有着密切关系。因此，该研究探讨HDAC3调控低氧诱导H9C2心肌细胞自噬的功能和分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

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细胞株 本实验所用大鼠H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。

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主要试剂 兔抗LC3B单克隆抗体、兔抗P62单克隆抗体、兔抗Beclin-1单克隆抗体、兔抗HDAC3单克隆抗体、兔抗mTOR单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；细胞培养试剂购自美国Gibco公司。HDAC3引物序列F：5′-GATGACCAGAGTTACAAGCACC-3′；R：5′-TTGAAGCAGCCTAATCGATCAC-3′；siRNA引物序列:5′-CTGCATTATGGTCTCTATATT-3′。

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实验仪器 细胞培养箱购自美国Thermo公司；低氧小室购自加拿大Stem Cell公司；蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；GE Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析系统购自美国GE公司。

1.2 方法

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心肌细胞低氧实验 大鼠H9C2心肌细胞用DMEM+10%FBS培养基培养，将H9C2细胞分为4组，对照组进行常氧培养，低氧组分为3组，分别是低氧1 h(1 h组)、低氧6 h(6 h组)、低氧12 h(12 h组)，然后将4组细胞放入正常恒温孵箱中培养。

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免疫荧光检测 爬满细胞的玻片以多聚甲醛固定清洗后，加入0.1% Triton X-100室温处理，然后加入牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA)，室温下封闭细胞1 h。孵育一抗，放入湿盒4 ℃冰箱过夜。避光条件下孵二抗1 h。DAPI染色10 min，用细胞仪检测细胞自噬的变化。

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Western blot 检测蛋白表达水平 收集心肌细胞裂解液，上样前先将样品置于沸水5 min变性，然后进行SDS-PAGE电泳并转膜至硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入适当稀释比的一抗室温下孵育12 h，洗膜后加二抗室温孵育2 h。经化学发光法曝光后观察结果，检测自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达变化，实验中以GAPDH为内参照。

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细胞转染实验 H9C2心肌细胞分组后，先后加入Opti-MEM和Lipofectamine 3000处理，分别转染HDAC3过表达质粒和siRNA 8 h。此时，将H9C2心肌细胞分为5组，分别为对照组(H9C2组)、siRNA空载质粒组(H9C2+siRNA NC组)、HDAC3敲减组(H9C2+siRNA组)、过表达空载质粒组(H9C2+OE NC组)、HDAC3过表达组(H9C2+OE组)。再次更换培养基，置于37 ℃、CO培养箱中培养48 h。

2 结果

2.1 低氧诱导H9C2心肌细胞自噬

为了验证低氧诱导H9C2心肌细胞的自噬，分别检测自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达变化。与对照组比较，在低氧后1 h，H9C2心肌细胞中LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白表达均增加(

P

<0.05)；在低氧6 h后LC3B-Ⅱ、Beclin-1增加最为显著(

P

<0.05)，而P62蛋白表达下降(

P

<0.05)；在低氧12 h后，LC3B-Ⅱ和P62蛋白表达水平虽有降低，但仍较对照组增高(

P

<0.05)，Beclin-1蛋白表达较对照组减少(

P

<0.05) (图1)。以上结果表明低氧可以诱导H9C2心肌细胞的自噬，在低氧后6 h最为明显。

图1 低氧诱导H9C2心肌细胞自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1和P62表达变化与对照组比较：*P<0.05

2.2 H9C2心肌细胞自噬过程中HDAC3蛋白表达增高

与对照组相比，低氧1 h和6 h后，H9C2心肌细胞中HDAC3蛋白表达显著升高(

P

<0.05)；而在低氧12 h后，HDAC3蛋白表达明显下降(

P

<0.05) (图 2)。以上结果表明低氧可诱导H9C2心肌细胞自噬过程中HDAC3蛋白表达增高(

F

=353.60，

P

<0.05)。

图2 低氧诱导H9C2心肌细胞HDAC3蛋白表达变化与对照组比较：*P<0.05

2.3 HDAC3促进了H9C2心肌细胞自噬

为了验证HDAC3调控H9C2心肌细胞自噬的功能，通过细胞转染HDAC3干扰RNA (H9C2+siRNA)下调HDAC3蛋白表达后。LC3B蛋白表达较对照组明显降低(

P

<0.05)；而转染HDAC3过表达质粒(H9C2+OE)上调HDAC3后，LC3B蛋白表达较对照组显著增高(

P

<0.05)(图 3A)。免疫荧光检测发现，与对照组比较，下调的HDAC3降低了LC3B的荧光活性(

P

<0.05)，上调HDAC3增加了LC3B的荧光活性(

P

<0.05) (图3B、3C)。以上结果表明HDAC3促进了低氧条件下H9C2心肌细胞自噬。

图3 HDAC3促进H9C2心肌细胞LC3B的蛋白表达和荧光活性变化A：LC3B与HDAC3蛋白相对表达量；B：LC3B荧光活性变化；a：H9C2组；b：H9C2+siRNA NC组；c：H9C2+siRNA组；d：H9C2+OE NC组；e：H9C2+OE组；与H9C2组比较：*P<0.05

2.4 HDAC3负性调控mTOR分子表达

为了探讨HDAC3促进H9C2心肌细胞自噬的分子机制，本课题研究调控细胞自噬的重要分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表达变化。与对照组比较，低氧后1 h 和6 h时mTOR蛋白表达逐渐增高，在12 h后表达降低(

P

<0.05)(图 4A)。下调HDAC3 蛋白表达(H9C2+siRNA)后，mTOR蛋白水平和荧光活性明显增高(

P

<0.05)；而上调HDAC3 蛋白表达(H9C2+OE)后，mTOR的蛋白水平和荧光活性显著降低(

P

<0.05) (图4B-4C)。以上结果提示HDAC3可以负性调控mTOR蛋白表达。

图4 mTOR蛋白相对表达量及免疫荧光水平A：低氧诱导H9C2心肌细胞mTOR蛋白表达增高；B:HDAC3负性调控mTOR蛋白表达；C:HDAC3负性调控mTOR荧光活性；a：H9C2组；b：H9C2+siRNA NC组；c：H9C2+siRNA组；d：H9C2+OE NC组；e：H9C2+OE组；与H9C2组比较：*P<0.05

3 讨论

自噬是细胞内蛋白质和亚细胞结构通过溶酶体降解的过程，是生理情况下细胞为适应各种刺激而维持其代谢的需要。应激状态下异常自噬影响了细胞自身正常的形态和功能，导致多种疾病的发生发展，过度应激可导致自噬增强，自噬体累积，并且产生过度自噬而引发细胞自我消化死亡。心肌细胞自噬是心室重构的重要原因之一，研究心肌细胞自噬的分子机制对逆转心室重构，以及对防治心力衰竭均有重要的意义。目前已有很多研究和实验证明了心肌缺血再灌注时的心肌细胞自噬作用，这些研究结果提示缺血再灌注诱导的心肌细胞自噬进一步增加，而心肌细胞的自噬在心肌缺血初期是起到保护作用的，在再灌注期间才产生了恶化作用。

本课题首先体外建立低氧诱导H9C2心肌细胞自噬模型，研究自噬相关蛋白的LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62表达变化。在细胞自噬过程中，LC3B-Ⅱ蛋白的高表达提示自噬水平的增高，是重要的自噬分子标志物。在低氧后1、6、12 h，LC3B-Ⅱ蛋白表达均增高(

P

<0.05)。Beclin-1是自噬过程中核心蛋白之一，影响自噬体的形成，并能诱导细胞的凋亡。在低氧后1 h和6 h表达均较正常对照组增高，12 h后降低(

P

<0.05)。P62是一种多功能癌基因蛋白，通过不同的蛋白作用域参与细胞选择性自噬过程。在低氧后1 h，P62蛋白表达增高，6 h后蛋白表达降低(

P

<0.05)，P62蛋白的这一变化和其他自噬研究结果相似。通过以上蛋白的检测，验证低氧诱导心肌细胞自噬成功。其中，在低氧后6 h，自噬水平最为显著，因此选取低氧6 h作为后续实验的时间点。

HDAC3是表观遗传学调控的重要分子，在机体内广泛分布，和心肌细胞肥厚和凋亡以及心肌纤维化和先天性心脏病的发生发展均有密切联系。研究显示，HDAC3参与了低氧复氧条件下肾小管上皮细胞的自噬。但是，HDAC3在心肌细胞自噬过程的功能和机制尚不明确。本研究发现，在低氧诱导H9C2心肌细胞自噬的过程中，HDAC3的蛋白表达增加，低氧6 h时最为显著。12 h后H9C2心肌细胞出现明显的死亡现象，HDAC3的表达有所降低。为了研究HDAC3调控H9C2心肌细胞自噬的功能，体外分别转染HDAC3过表达质粒和干扰RNA。研究发现细胞转染过表达质粒能够明显上调H9C2细胞中HDAC3蛋白表达，而干扰RNA能够明显降低HDAC3蛋白表达。进一步研究发现，上调HDAC3后LC3B蛋白表达增加和荧光活性增高，而下调HDAC3后LC3B蛋白表达降低和荧光活性减少。这些结果表明在低氧情况下，HDAC3促进了H9C2心肌细胞自噬。mTOR是能够参与多种信号通路的调节分子，在细胞凋亡和自噬过程中具有重要的作用。在H9C2心肌细胞自噬的过程中，mTOR蛋白表达增加，但HDAC3是否通过调控mTOR来实现促进心肌细胞自噬的机制并不清楚。本研究发现，上调HDAC3后mTOR蛋白表达降低和荧光活性减少，而下调HDAC3后mTOR蛋白表达升高和荧光活性增加，提示了在H9C2心肌细胞自噬的过程中，HDAC3负性调控mTOR的表达。

低氧诱导H9C2心肌细胞自噬和HDAC3的表达具有时间特异性。HDAC3负性调节mTOR蛋白，促进了低氧诱导的H9C2心肌细胞自噬。本研究阐述了心肌细胞自噬的可能分子机制，为预防心室重构和心力衰竭提供了新的思路和治疗靶点。