不同Sap酶活性的白假丝酵母菌对阴道上皮细胞表达NLRP3炎性小体的影响

侯梦瑶，邵明琨，罗丹丹，祁文瑾

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是由假丝酵母菌引起的女性下生殖道最常见的感染性疾病之一，居女性生殖道炎症第二位病因，白假丝酵母菌是最常见的致病菌种，属于机会致病菌，健康状态下，在阴道的微环境中与宿主和其他局部微生物群处于共生状态，其中某个因素改变都容易导致平衡被打破，假丝酵母菌由酵母相变为菌丝相而致病，对阴道黏膜造成损伤。阴道局部免疫系统被激活，发动先天性和适应性免疫保护机体。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3]炎性小体就是其中关键的因子，可以被白假丝酵母菌的主要毒力因子之一分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted of aspartic proteases, Sap)所激活。它是一种蛋白复合体，属于机体先天免疫的一部分。当受到损伤因子刺激后，NLRP3蛋白与衔接子凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain, ASC)相互作用启动炎性小体形成，ASC同时募集并激活效应子半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteiny aspartate specific protease-1, caspase-1)前体以产生活性的caspase-1，caspase-1剪切白细胞介素(interleukin, IL)-1β前体和IL-18前体形成具有生物学活性的IL-1β和IL-18，从而触发一系列的炎症反应。该研究主要探索不同Sap酶活性的白假丝酵母菌对人和小鼠阴道上皮细胞表达NLRP3炎性小体、IL-1β和IL-18的影响，期望能为进一步明确VVC的发病机制提供新的研究理论。

1 材料与方法

1.1 实验材料

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生物材料 白假丝酵母菌来源于昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊的VVC患者；人阴道上皮组织来自同一医院的妇科子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除患者，患者未绝经且既往身体健康，以上均取得患者知情同意，通过本院伦理委员会批准。小鼠购自昆明医科大学SPF动物房，雌性昆明小鼠，6～8周龄，体质量22～28 g。

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主要试剂 沙堡罗氯霉素培养基(法国生物梅里埃公司)；念珠菌显色平板(上海安图生物公司)；无菌脱脂奶粉(上海生物工程股份有限公司)；角化细胞无血清培养基(K-SFM，美国Gibco公司)； DMEM/F12完全培养基(美国Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美国Sigma公司)；胰酶(美国Gibco公司)；NLRP3炎性小体抗体(anti-NLRP3 antibody，杭州华安生物技术有限公司)；牛血清白蛋白V(美国Solarbio公司)；免疫荧光二抗、DAPI(美国Invitrogen公司)；人IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒及小鼠IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒(深圳欣博盛科技有限公司)；改良HE染色试剂盒(美国Solarbio公司)。

1.2 实验方法

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假丝酵母菌纯化、菌种鉴定及Sap酶活性检测 纯化：用无菌棉拭子将VVC患者阴道分泌物接种到沙堡罗培养皿上，培养48 h后分离单菌落扩增保存。菌种鉴定：严格按安图念珠菌显色平板说明书进行鉴定。Sap酶活性测定：将配成5×10CFU/ml浓度的菌液滴到牛奶培养皿固定位置，长出菌落圈和沉淀圈后用游标卡尺测量直径并计算出比值，以PA值(菌落圈直径/菌落圈直径+沉淀圈直径)表示，每个菌以3个结果的平均值来计算Sap酶活性。

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阴道上皮细胞培养 取人和小鼠新鲜阴道组织后采用DispaseⅡ和胰酶分步消化法，DispaseⅡ浸泡4 ℃冰箱过夜。分离阴道黏膜层并剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化、DMEM/F12完全培养基终止消化，离心后K-SFM培养液重悬细胞并计数，按1×10个/ml的浓度将细胞接种于25 cm细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO培养箱培养。48 h后观察细胞生长情况并首次换液，每隔2～3 d换液并观察细胞。当贴壁细胞数达70%～80%时进行传代，按1×10个/ml的浓度将细胞接种于24孔板内培养，贴壁细胞数达70%～80%时进行下一步。

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阴道上皮细胞与白假丝酵母菌共培养 白假丝酵母菌菌液配置：K-SFM培养液配置菌液，浓度为1×10CFU/ml。细胞与菌共培养：实验分为3组进行，分别为空白对照组(只加K-SFM培养液)、Sap酶活性强组和Sap酶活性弱组。分别于6、12、24、48 h将配好的菌液加入到相应孔内，空白对照孔由K-SFM培养液代替，37 ℃、5%CO培养箱培养。48 h后同时收取上清液，-80 ℃冰箱避光保存，24孔板内的细胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定,4 ℃冰箱保存。

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免疫荧光法检测阴道上皮细胞NLRP3炎性小体的表达 取已用4%多聚甲醛固定的细胞，柠檬酸盐修复液修复后加通透液，PBS清洗，5%牛血清白蛋白37 ℃封闭，再加NLRP3炎性小体抗体(1 ∶100稀释)4 ℃冰箱过夜，复温后PBS清洗，按说明加入稀释荧光二抗(1 ∶500稀释)，37 ℃孵育，加入DAPI染色9 min，PBS清洗后荧光显微镜下观察并拍照。每个组选7～8张图用Image Pro Plus软件做荧光定量，并根据细胞核的数量进行荧光均一化处理后再做统计学分析。

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ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、IL-18的表达 复溶已收取的细胞上清液,分别取100 μl并严格按照ELISA试剂盒说明书操作，作出标准曲线并根据其最后计算出IL-1β、IL-18的实际浓度。

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HE染色观察细胞形态 取已用4%多聚甲醛固定的细胞，PBS清洗后用苏木精染色2 min，蒸馏水清洗，分化液分化后加反蓝液，自来水清洗，伊红染色20 s后95%乙醇溶液2～3 s，无水乙醇3 min(重复2次)，镜下观察细胞并拍照。

2 结果

2.1 假丝酵母菌鉴定情况及Sap酶活性检测结果

在念珠菌显色平板上长出的菌落显色为绿色或翠绿色则为白假丝酵母菌。牛奶培养基平皿上可看到菌落圈和沉淀圈即为Sap阳性菌株，PA值越低，表明菌株Sap酶活性越强，反之则越弱。挑选Sap酶活性弱(PA=0.634±0.019)与Sap酶活性强(PA=0.254±0.003)的白假丝酵母菌各8株，测定的Sap酶活性强弱差异有统计学意义(

F

=380.44，

P

<0.05)。见图1。

图1 纯化鉴定及Sap酶活性测定A：用安图念珠菌显色培养板进行菌种鉴定；B：牛奶培养基进行Sap酶活性测定；蓝色圈：菌落圈；红色圈：沉淀圈

2.2 阴道上皮细胞培养情况

人阴道上皮细胞消化后传到培养瓶中，6～7 d时贴壁细胞数可达70%～80%，而小鼠阴道上皮细胞只需4～5 d；细胞呈铺路石样生长，形态为多角形，轮廓清晰，折光线好，确认为阴道上皮细胞。见图2。

图2 光学显微镜观察细胞培养第6天的形态 ×100A：人阴道上皮细胞；B：小鼠阴道上皮细胞

2.3 NLRP3炎性小体检测结果

人阴道上皮细胞与白假丝酵母菌共培养后，阴道上皮细胞表达的NLRP3炎性小体水平从6 h开始升高，12 h达高峰后逐渐下降；同时荧光图片显示共培养24 h后，阴道上皮细胞开始裂解，至48 h时可看到细胞破裂死亡，荧光随之减弱，而空白对照组的细胞形态从始至终都是完整的，荧光量保持相对稳定，Sap酶活性强组NLRP3炎性小体水平下降趋势更明显。此外，人阴道上皮细胞与白假丝酵母菌共培养6、12、48 h，Sap酶活性弱组和Sap酶活性强组与空白对照组的NLRP3炎性小体水平相比差异有统计学意义(

P

<0.05)。Sap酶活性强组在12 h时与Sap酶活性弱组的NLRP3炎性小体水平差异有统计学意义(

F

=8.05，

P

<0.05)，但6、24、48 h两组间的NLRP3炎性小体表达差异无统计学意义。见图3。

图3 人阴道上皮细胞NLRP3炎性小体表达量 ×400A：空白对照组；B：Sap酶活性弱组；C：Sap酶活性强组；D：三组荧光表达；绿色荧光：NLRP3炎性小体；蓝色荧光：DAPI核染色；与空白对照组比较：*P<0.05；与Sap酶活性弱组比较： #P<0.05

2.4 IL-1β、IL-18的测定结果

白假丝酵母菌与人阴道上皮细胞共培养6、12、24、48 h，IL-1β和IL-18水平均在6 h达峰值后逐渐下降趋势，至48 h时随着细胞膜的破裂，细胞内IL-1β和IL-18全部被释放出来，又出现了小幅度的回升。Sap酶活性强组IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h与空白对照组相比差异有统计学意义(

F

=24.40、8.38，

P

<0.05)，两因子3组间

F

值分别为24.40、8.38；而Sap酶活性弱组仅有IL-1β水平在6、12、24 h与空白对照组差异有统计学意义(

P

<0.05)，Sap酶活性强组IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h与Sap酶活性弱组相比差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图4。

图4 人阴道上皮细胞IL-1β和IL-18的表达量与空白对照组比较：*P<0.05；与Sap酶活性弱组比较：#P<0.05

2.5 HE染色结果

空白对照组的细胞边界清晰，饱满，折光性好；而阴道上皮细胞与白假丝酵母菌共培养48 h后可看到大部分细胞边界模糊，部分已裂解，活力较差。见图5。

图5 光学显微镜观察HE染色人阴道上皮细胞形态 × 400A：空白对照组B：白假丝酵母菌与阴道上皮细胞共培养48 h

2.6 小鼠阴道上皮细胞3种因子表达情况

小鼠阴道上皮细胞与不同Sap酶活性的白假丝酵母菌共培养12 h，NLRP3炎性小体、IL-1β、IL-18 3种因子水平均高于空白对照组(

F

=32.3、10.39、11.13，

P

<0.05)，各个因子3组间

F

值分别为32.03、10.39、11.13，Sap酶活性强组的表达水平均高于Sap酶活性弱组(

P

<0.05)。趋势与人阴道上皮细胞一致。见图6。

图6 小鼠阴道上皮细胞12 h时间点各因子表达量A：空白对照组；b：Sap酶活性弱组；c：Sap酶活性强组；与空白对照组比较：*P<0.05；与Sap酶活性弱组比较： #P<0.05

3 讨论

Sap是由白假丝酵母菌分泌的一种胞外水解酶，有助于致病菌黏附、侵入宿主黏膜屏障和逃逸宿主免疫的攻击。有研究表明，Sap基因缺失的突变菌造成的上皮损伤较轻且产生的细胞因子也会下降。因此Sap酶活性长期以来都被认为是致病白假丝酵母菌的重要毒力特征，且对激活NLRP3炎性小体至关重要。本研究选取白假丝酵母菌与体外阴道上皮细胞共培养，结果显示NLRP3炎性小体水平早期即达高峰，之后随着细胞的破坏、死亡，表达量逐渐下降。由此活化的IL-1β和IL-18可分别驱动Th17和Th1细胞的早期分化，Th1主要通过分泌IFN-γ募集巨噬细胞等发挥抗感染作用，Th17分泌IL-17和IL-23等细胞因子抵御假丝酵母菌感染，NLRP3炎性小体缺陷的小鼠对白假丝酵母菌的播散性和易感性都增加了。所以，NLRP3炎性小体作为先天免疫系统的重要成员，在感染早期可立即启动保护性适应性免疫反应抵御病菌。

然而，NLRP3炎性小体若被过度激活,一方面，引发的炎症细胞因子和趋化因子不仅不能充分杀灭真菌降低阴道上皮细胞的损伤，反而使阴道上皮处于高炎症状态，导致免疫病理性炎症。另一方面， NLRP3炎性小体可裂解并激活成孔蛋白gasdermin D，从而在质膜上形成孔导致细胞焦亡，该机制可能造成细胞大量死亡。本研究选取不同Sap酶活性的白假丝酵母菌与阴道上皮细胞共培养，发现NLRP3炎性小体、IL-1β和IL-18的水平均高于空白对照组，说明白假丝酵母菌能刺激阴道上皮细胞表达更多的NLRP3炎性小体及相关因子，且这个表达量与白假丝酵母菌的Sap酶活性成正比。推测Sap酶活性强的菌可能诱导NLRP3炎性小体的过度表达，引发高炎症反应及细胞死亡，从而导致阴道的局部病理损伤更严重。最后，本研究还发现不同Sap酶活性的白假丝酵母菌感染小鼠阴道上皮细胞后，与人阴道上皮细胞免疫因子表达的趋势基本一致，因此可以用小鼠代替人进行VVC体内实验。

综上所述，在VVC的发病机制中，NLRP3炎性小体可能是一把双刃剑，激活后既能通过活化IL-1β和IL-18启动机体的保护性免疫应答，又可能因过度激活而造成机体的免疫病理状态。不同Sap酶活性的白假丝酵母菌与阴道上皮细胞共培养后，对NLRP3炎性小体的激活程度不完全一致，所以Sap酶活性强的菌可能更容易造成免疫病理损伤，引起的临床症状可能更严重，这也许是临床上不同VVC患者临床症状和体征存在差异的原因。但体外实验并不能完全反映体内阴道黏膜局部的免疫状态，还需进一步的体内实验来论证这一观点，从本研究结果来看，小鼠可以代替人进行这一部分的体内实验。