七叶皂苷钠通过降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黄疸大鼠小胆管增生

汪先凯，周大臣，喻宗繁，崔 笑

梗阻性黄疸是一种常见的临床病症，是机体胆汁流出道受阻，如胆管结石、肿瘤及炎症增生等致使胆管变窄或完全阻塞，胆红素代谢障碍并返流入血，造成巩膜、黏膜黄染。梗阻性黄疸可诱导肝细胞坏死、胆管增生，并发严重的淤胆性肝纤维化甚至肝衰竭。世界范围内，梗阻性黄疸造成淤胆性肝纤维化呈逐年上升的趋势。对于梗阻性黄疸继发的胆性肝纤维化，解除胆道梗阻是最根本的治疗措施。然而即使进行胆管引流治疗，肝功能的恢复仍然面临着一些困难。因此寻找一种方式去减轻患者梗阻性黄疸淤胆情况及加快患者肝纤维化恢复具有重要临床意义。大鼠胆管结扎致使肝脏汇管区周围小胆管大量增生以及淤胆性肝纤维化的形成，能较好地模拟临床疾病梗阻性黄疸。七叶皂苷钠(商品名:麦通钠)是从七叶树科植物天师栗的干燥成熟果实娑罗子中提取得到的天然三萜糖苷类化合物的钠盐。本课题组前期研究显示七叶皂苷钠对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化具有显著的防治作用，且有研究表明七叶皂苷钠对肝细胞膜有保护作用，可以改善急性肝损伤。该实验对胆管结扎大鼠模型展开相关研究，探究七叶皂苷钠对于梗阻性黄疸大鼠肝脏组织汇管区周围小胆管的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

注射用七叶皂苷钠(山东绿叶制药有限公司)；伊红染液(BL703A,合肥Biosharp公司)；苏木精染色液(PH0516,福州飞净生物科技有限公司)；兔抗磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(phosphorylated eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，p-4EBP1)单克隆抗体(236B4，#2855，美国CST公司)；兔抗真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)单克隆抗体(53H11,#9644,美国CST公司)；兔抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体(A11111，武汉爱博泰克生物科技有限公司)；兔抗Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，COL-Ⅰ)蛋白多克隆抗体(BA0325)、鼠抗Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ，COL-Ⅲ)蛋白单克隆抗体(BM1625)(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(K186916P，北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔二步法荧光检测试剂盒(PV-9001)、超敏二步法免疫组化检测试剂盒(PV9001)、小鼠二步法荧光试剂盒(PV-6002)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAPI染色液(C1006，上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；Masson三色染色液(固绿法，G1343)、牛血清白蛋白(blood serum albumins，BSA)(北京索莱宝科技有限公司)。

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主要仪器 蔡司Axioscope5正置荧光显微镜(德国ZEISS公司)；分析天平(上海精天电子仪器有限公司)；高速低温离心机(美国Eppendorf公司)；脱色摇床(北京六一生物科技有限公司)；CryoStar NX50型冷冻切片机(上海赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 实验动物及处理方法

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量150～200 g，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证号:SCXK(皖)2017-001。在室温20～25 ℃、湿度40%～60%、12 h照明与12 h黑暗交替的环境中饲养，自由进食、饮水，将81只健康雄性SD大鼠在适应性喂养3 d后进行胆管结扎手术。大鼠术前禁食8 h，禁水4 h。以水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。剃去腹部毛发，以碘伏仔细消毒皮肤。从剑突到耻骨作腹部正中切口，解剖肝门部，寻找胆总管，4-0丝线双重结扎胆总管。2-0带针手术缝线缝合腹膜、肌层和皮肤。假手术组仅剖腹游离肝门部胆总管，不予结扎，2-0带针手术缝线缝合腹膜、肌层和皮肤。手术后24 h，胆管结扎大鼠随机分为3组:单纯胆管结扎组(

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=36)、七叶皂苷钠组(

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=27)、假手术组(

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=18)。七叶皂苷钠组大鼠每日予以腹腔注射3.6 mg/kg七叶皂苷钠溶液(溶于0.9%氯化钠溶液配制为1 g/L溶液)1次,单纯胆管结扎组和假手术组同期给予相同体积的0.9%氯化钠溶液，其余饲养条件相同。连续给药7 d后处死实验大鼠，下腔静脉采血离心(3 000 r/min，15 min)，获得血清样本。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝右叶组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH=7.4)中,用于组织病理学研究。剩余肝脏样本及制备好的血清样本保存于-80 ℃ 的冰箱。

1.4 检测方法及指标

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病理学观察 肝组织标本于4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，常规脱水，包埋，制备石蜡切片，厚度为5 μm。参照标准方法进行苏木精-伊红染色及Masson染色，二甲苯透明，中性树脂封片，切片由不知道分组情况的研究员显微镜下读片。

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肝组织免疫组化 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水洗。抗原修复：放入pH值为6.0枸橼酸钠缓冲液中(含0.05% Tween-20)，在高压锅中煮沸10 min，自来水慢速冲洗降温20 min。3%过氧化氢-甲醇混合液孵育10 min灭活内源性过氧化物活性。TBST溶液(TBS+0.2% Triton-X,pH=7.6)室温下浸泡组织切片10 min。山羊血清封闭内源性生物素90 min，一抗(α-SMA、4EBP1、p-4EBP1 1 ∶100稀释)4 ℃孵育过夜。次日回收一抗，按照二抗试剂盒说明书操作滴加二抗。DAB显色，显微镜下控制时间。蒸馏水洗，苏木精复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，切片由不知道分组情况的研究员显微镜下读片。

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肝组织免疫荧光 肝组织标本于4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，30%蔗糖磷酸缓冲盐溶液4 ℃过夜脱水，OTC包埋，制备冰冻切片，厚度要求6 μm。冰冻切片室温复温30 min，PBS(pH=7.4)洗3次，每次5 min，10%正常山羊血清封闭120 min。滴加一抗(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ 1 ∶100稀释)4 ℃孵育过夜。按照试剂盒说明操作滴加荧光二抗(1 ∶500稀释)，DAPI室温湿盒避光孵育，抗荧光淬灭剂封片。切片由不知道分组情况的研究员显微镜下读片。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对大鼠梗阻性黄疸引起的肝纤维化的影响

除假手术组外，其余各组均于胆管结扎术后48～72 h出现黄疸，表现为尿液颜色加深，耳朵、眼睛、毛发及皮肤黄染，粪便呈浅灰色或陶土色。同一时间七叶皂苷钠组大鼠在活动、进食及黄疸症状等方面均较单纯胆管结扎组大鼠好。解剖实验大鼠，胆管结扎组大鼠肝脏均出现肿大、变硬、肝缘变钝及片状坏死，个别甚至出现腹腔积液；七叶皂苷钠组大鼠肝脏情况较胆管结扎组有显著改善。HE染色、Masson染色及α-SMA的免疫组化结果显示(图1)，假手术组大鼠肝脏肝索呈放射状，未见结缔组织增生，肝脏形态结构正常，无纤维化症状；单纯胆管结扎组大鼠肝脏肝索结构紊乱，间隙扩张，空泡增多，并明显可见肝细胞大片状坏死现象，炎症细胞浸润几乎布满整个显微镜视野。七叶皂苷钠组大鼠肝脏肝纤维化程度明显减轻，肝索排列较整齐，有少量空泡，肝小叶结构欠规则。与假手术组相比，单纯胆管结扎组大鼠肝脏胶原纤维的面积及平均胶原密度等指标均明显增高，见表1。而七叶皂苷钠组大鼠肝脏胶原纤维面积及平均胶原密度等指标较单纯胆管结扎组大鼠肝组织显著减少。七叶皂苷钠可以明显减轻梗阻性黄疸模型大鼠引起的肝纤维化。

图1 各组大鼠肝组织HE染色、Masson染色、α-SMA的免疫组化染色 ×200

表1 各组大鼠肝组织胶原纤维堆积比较

2.2 七叶皂苷钠对大鼠梗阻性黄疸继发的肝脏胶原纤维的影响

COL-Ⅰ纤维被特异性染成绿色，COL-Ⅲ纤维呈红色(图2)。与假手术组相比，单纯胆管结扎组大鼠肝组织内COL-Ⅰ、COL-Ⅲ纤维的表达量均显著升高。七叶皂苷钠组大鼠肝脏绿色及红色纤维束均明显少于胆管结扎组大鼠(表2、图2)。七叶皂苷钠可以明显抑制梗阻型黄疸大鼠模型的胶原纤维的产生。

图2 各组大鼠肝脏胶原纤维免疫荧光 ×200

表2 各组大鼠肝脏COL-Ⅰ、COL-Ⅲ纤维免疫荧光强度比较

2.3 七叶皂苷钠抑制胆总管结扎大鼠肝脏汇管区小胆管增生及胆管细胞内4EBP1的磷酸化

由图3可见，假手术组大鼠肝脏结构规则，汇管区周围未见胆管增生，免疫组化染色未见4EBP1的表达以及其磷酸化。胆管结扎组大鼠肝脏相比假手术组大鼠肝脏汇管区周围可见大量的胆管，且胆管的柱状上皮细胞内可见4EBP1及p-4EBP1明显表达。七叶皂苷钠组大鼠肝脏汇管区周围仅存在少量的胆管，胆管细胞内可见4EBP1阳性表达，而p-4EBP1未见在七叶皂苷钠组大鼠肝脏内阳性表达。七叶皂苷钠可以明显抑制梗阻性黄疸大鼠模型引起的胆管增生，并降低小胆管细胞内p-4EBP1的表达。

图3 各组大鼠肝脏HE染色、Masson染色、免疫组化染色结果

3 讨论

近几年，对于肝纤维化、梗阻性黄疸等疾病研究的越来越多，其病理变化及其防治也研究的越来越透彻，制备梗阻性黄疸动物模型是实验取得重大进展的重要因素之一，如本课题组前期使用腹腔注射四氯化碳诱使大鼠肝脏损伤，成功构建肝纤维化模型。但同时也存在制备动物模型时间长、毒性大、与临床疾病状态不符等缺点。本实验采用的是SD野生型大鼠，手术简便，价格低廉，并能较好地模拟临床上梗阻性黄疸患者引起的淤胆性肝纤维化，具有代表性。

肝内外胆道梗阻致使胆汁排泄不畅是梗阻性黄疸的主要病因，表现为巩膜、黏膜甚至全身皮肤黄染症状。梗阻性黄疸对肝脏损伤最为严重，其肝细胞损伤机制较为复杂，如胆汁酸滞留、血流动力学紊乱、肝细胞稳态失调等均可促进肝细胞坏死。肝纤维化是在多种致病因子的作用下促进肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)激活，HSC激活转化为肌成纤维细胞表型，并开始表达α-SMA，分泌大量的COL-Ⅰ和COL-Ⅲ并造成细胞外基质的过度沉积，最终形成肝纤维化。有研究表明龙血竭总黄酮可以通过抑制HSC的激活及减少胶原纤维的生成和降解，从而达到有效缓解肝纤维化的作用。本课题组前期研究也表明七叶皂苷钠通过抑制HSC的激活降低COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达，进而减少细胞外基质的产生实现其抗纤维化作用。而在本研究中，七叶皂苷钠可以减少梗阻性黄疸大鼠α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达，因此七叶皂苷钠可以抑制HSC的激活，改善梗阻性黄疸导致的肝纤维化。

4EBP1是一种重要的蛋白翻译调节因子，主要调控Cap-依赖型的mRNA的翻译过程。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路可以对下游靶分子4EBP1发挥磷酸化的调控作用，抑制4EBP1磷酸化水平，减少细胞内蛋白的表达量，抑制细胞的生长增殖，诱导其凋亡。有研究表明P13K/mTOR信号通路被阻断后，HSC的收缩、转移等能力受到抑制，COL-Ⅰ纤维的表达量明显减少，肝纤维化反应显著改善。在本研究中，胆管结扎组大鼠肝脏汇管区周围胆管数量明显多于假手术组，增生的小胆管破坏肝脏组织原本的正常生理结构导致能量代谢障碍，进一步损伤肝组织，导致肝纤维化的产生。而且在增生胆管细胞中4EBP1和p-4EBP1的水平也明显升高。这表明4EBP1的磷酸化激活参与调控梗阻性黄疸大鼠肝脏汇管区周围小胆管细胞的生长增殖。同时七叶皂苷钠可以减少梗阻性黄疸大鼠肝组织汇管区周围小胆管增生以及胆管细胞内p-4EBP1的表达，而不影响4EBP1的表达。本课题组前期研究表明七叶皂苷钠可以下调HSC-T6细胞内4EBP1的磷酸化水平，从而减少成纤维细胞的产生。另有研究也表明4EBP1的磷酸化激活可以促进COL-Ⅰ蛋白的产生并诱导HSC转化激活,因此可以认为七叶皂苷钠可以通过抑制胆管细胞内p-4EBP1的表达减少梗阻性黄疸大鼠胆管细胞的产生以及汇管区周围小胆管的增生。

综上所述，七叶皂苷钠可以减少梗阻性黄疸大鼠肝组织汇管区周围小胆管的增生，其与4EBP1的磷酸化水平有关。并且七叶皂苷钠可以作为临床治疗梗阻性黄疸的潜在药物，同时七叶皂苷钠的分子机制是多方面的，该研究仅在动物实验上观察到这一现象，尚未进行细胞机制验证，存在一定的局限性。