Er,Cr:YSGG激光清除SLA钛表面牙龈卟啉单胞菌生物膜

余金兰，夏 荣，刘 春，徐基亮，孙 磊

种植体周围炎是一种发生在种植体周围的炎症性疾病，表现为种植体周围软组织炎症和骨丧失，是种植失败的常见原因之一，发病率约为22%。研究表明，慢性牙周炎病史、吸烟等虽可以增加种植体周围炎的发病风险，但与牙周病类似，菌斑生物膜依旧是其始动因子。因此，治疗种植体周围炎的首要目标是彻底有效地清除种植体表面污染，暴露微结构。近些年，激光已被用于治疗种植体周围炎，它们能消融种植体表面的菌斑、牙石，还可以清除细菌毒素、脂多糖；局部使用不会引起全身反应；减少术中出血、疼痛和术后肿胀。但激光的治疗效果受功率、频率等多种因素影响。该研究旨在探究应用不同功率Er,Cr:YSGG激光清除喷砂酸蚀(sandblasted, large-grit, acid-etched, SLA)钛表面牙龈卟啉单胞菌生物膜的效果。

1 材料与方法

1.1 实验设备和试剂

Er,Cr:YSGG水激光口腔治疗仪(美国Biolase公司)；商业纯钛(TA1)(东莞冠跃金属材料有限公司)；GeminiSEM500扫描电子显微镜、LSM880激光扫描共聚焦显微镜(德国卡尔·蔡司公司)；麦氏比浊仪(上海梅里埃诊断产品有限公司)；Invitrogen L-7012 活/死菌细菌活力试剂盒、多功能微孔板酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)；牙龈卟啉单胞菌(北京百欧博伟生物技术有限公司)；人工唾液、脑心浸液培养基(brain heart infusion，BHI)(上海索莱宝生物科技有限公司)；结晶紫溶液、抗荧光淬灭剂(上海碧云天生物技术有限公司)；维生素 K1 注射液(上海信然原装生物试剂)。

1.2 试件制备

纯钛试件(直径10 mm×1 mm)经75%乙醇溶液清洗后进行SLA处理。AlO砂粒(120 μm)在0.45 MPa气压下垂直喷射轰击试件30 s，距离为5 cm。随后浸入18%盐酸和48%硫酸以1 ∶1(

v/v

)的混合酸溶液中，60 ℃水浴加热30 min，双蒸水超声振荡15 min。制备成功的 SLA钛试件储存于0.9%氯化钠溶液中，使用前环氧乙烷消毒灭菌。

1.3 牙龈卟啉单胞菌生物膜制备

冻存的牙龈卟啉单胞菌菌株于BHI血琼脂培养基上复苏，37 ℃厌氧环境(80% N、10% CO、10% H)培养72 h。挑取血琼脂培养基上单菌落于BHI血清培养基中制备成6×10CFU/ml的菌悬液。将试件置于24孔培养板内，受试面朝上，加入500 μl 0.22 μm滤膜过滤后的人工唾液，静置过夜以形成人工获得性膜。获得性膜形成后各孔内分别加入1 ml上述菌悬液，37 ℃厌氧培养72 h。

1.4 激光处理与分组

Er,Cr:YSGG激光处理：采用Er,Cr:YSGG激光器(波长2 780 nm，功率0.75 W或1.5 W，频率30 Hz，脉冲时间140 μs，空气压力40%，水压力40%)，选用MZ6工作尖(直径600 μm)，离试件表面2 mm，垂直于试件表面照射，单次照射时间30 s。采用系统抽样将所有试件随机分为3组，每组11枚。NL组：不做任何处理；L1组：0.75 W的Er,Cr:YSGG激光处理；L2组：1.5 W的Er,Cr:YSGG激光处理。

1.5 扫描电子显微镜观察

每组随机抽取3枚试件，PBS冲洗去除试件表面黏附不牢的细菌。2.5%戊二醛固定1 h，PBS清洗后，50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液梯度脱水，干燥，喷金，扫描电子显微镜下观察各组SLA试件表面牙龈卟啉单胞菌生物膜情况。

1.6 活/死细菌染色

利用L-7012 活/死菌细菌活力试剂盒鉴别SLA试件表面活/死细菌。将SYTO9、PI、蒸馏水按1.5 μl ∶1.5 μl ∶1 ml 的比例配制成荧光染液，避光备用。每组随机抽取3枚试件，PBS冲洗去除试件表面黏附松散的细菌，吸取200 μl上述荧光染液滴于试件表面，于室温、黑暗条件下孵育15 min，PBS轻洗。黑暗环境中，在试件表面滴一滴抗荧光淬灭剂, 4 ℃避光存放并立即镜检。将试件倒置在载波片上，激光扫描共聚焦显微镜(×40)下观察。

1.7 结晶紫染色法检测试件表面的细菌数量

激光处理后，各组随机选取5枚试件。2.5%戊二醛固定30 min，弃去固定液，PBS轻洗，烘箱37 ℃干燥，加入1 ml 1%结晶紫溶液，振摇20 min，然后用PBS将游离染料彻底清洗干净，加入1 ml 33%醋酸溶液，充分震荡，酶标仪测量波长590 nm处的吸光度(optical density，OD)值。

2 结果

2.1 扫描电子显微镜观察

干净SLA钛表面形态不规则，可见大小不一的微米级凹陷，边缘较锐利(图1A)。各组试件表面牙龈卟啉单胞菌生物膜的扫描电子显微镜图如图1B～1D。NL组：获得性膜形成，覆盖粗糙表面，其上大量细菌定植繁衍；L1组：牙龈卟啉单胞菌生物膜表层被清除，试件表面仍覆盖大量获得性膜和少量细菌；L2组：试件表面结构暴露，暴露区域的形态结构与干净SLA钛表面无区别，未观察到熔化、融合等结构改变。

图1 试件表面牙龈卟啉单胞菌生物膜的扫描电子显微镜图 ×2 500A：干净SLA钛表面；B：NL组；C：L1组；D：L2组

2.2 活/死细菌染色结果

NL组：试件表面含有大量的绿色荧光(活菌)和部分红色荧光(死菌)，经激光处理后，荧光成分明显减少；L1组：少量绿色荧光(活菌)散在分布；L2组：可见零星绿色荧光(活菌)。见图2。

图2 试件表面活/死细菌染色的激光扫描共聚焦显微镜图 ×40A：NL组；B：L1组；C：L2组；红色：死菌；绿色：活菌

2.3 试件表面的细菌数量

采用单因素方差分析比较3组之间的差异，NL组OD值最大，而经激光处理后，L1组、L2组OD值减少，与NL组差异有统计学意义(

F

=2 588.12，

P

<0.001)。虽然L2组的OD值小于L1组，但两组之间差异无统计学意义(图3)。

图3 结晶紫染色法检测各组试件表面的细菌数量与NL组比较：***P<0.001

3 讨论

种植体周围炎作为常见的种植并发症之一，可以引起种植体周围组织炎症，骨组织吸收，进而引起种植体松动、脱落。近年来，激光应用于种植体周围炎的治疗，它们可以杀灭种植体表面存在的微生物，消融菌斑、牙石，还可以粗化种植体表面以便于再次发生骨结合。Er,Cr:YSGG激光的吸收系数与水及羟基磷灰石的吸收峰值相匹配，可释放波长2 780 nm的高速动能水分子以完成组织的切割及消融。在种植体周围炎的治疗过程中，菌斑、牙石中的羟基磷灰石和水被吸收，从而完成种植体表面去污；而当其作用于软组织时，能达到很好的切割和止血效果，降低水肿的发生，避免切割后创面结痂，降低感染的可能性，同时还可以加快组织愈合。

Ercan et al用扫描电子显微镜定性评估经不同参数Er,Cr:YSGG激光照射后不同种植体表面的形貌变化，发现不同参数会不同程度地影响种植体表面，而不同种植体表面经同一参数激光照射后影响程度亦不相同，说明频率、功率、照射时间、照射距离以及种植体表面类型等都会影响激光对种植体的作用。因此，在治疗过程中频率、功率、照射时间、照射距离以及种植体表面类型等参数都应慎重考虑。有研究表明当Er,Cr:YSGG激光的能量密度小于等于50 mJ/pulse(20 Hz)，SLA微结构表面未观察到改变；但能量密度为60 mJ/pulse时，可观察到颜色变化。该实验所使用的激光参数(0.75 W或1.5 W)亦未在试件表面造成融化、融合等结构改变。

实验利用活/死细菌染色和结晶紫染色法检测各组表面细菌情况，两者具有相同趋势：经0.75 W或1.5W的Er,Cr:YSGG激光处理后，活/死细菌染色后在激光扫描共聚焦显微镜下几乎看不到细菌的存在，结晶紫染色法的结果显示0.75 W或1.5 W的Er,Cr:YSGG激光组之间差异无统计学意义。然而在扫描电子显微镜下，0.75 W的Er,Cr:YSGG激光组试件表面仍有大量获得性膜覆盖，遮挡其原有形貌，1.5 W的Er,Cr:YSGG激光组试件表面几乎观察不到生物膜的存在。这种结果的产生可能是由于实验制备的牙龈卟啉单胞菌生物膜，细菌黏附定植于获得性膜表面，激光处理时，激光束和水/气首先作用于细菌，因此在试件表面几乎观察不到细菌的存在，而0.75 W的Er,Cr:YSGG激光组由于设置的功率较小或作用时间较短，不能完全清除试件表面上的获得性膜。Schwarz et al的实验结果显示Er,Cr:YSGG激光具有功率、时间依赖的清除菌斑生物膜的能力，随着设置功率的增加，残余菌斑面积显著减小，但当激光功率设为2 W或2.5 W时，会影响表层化学组成，从而降低表面细胞活力。Strever et al的研究表明1.0～1.5 W Er,Cr:YSGG激光可以清除种植体表面95%以上的牙龈卟啉单胞菌并且不破坏其表面结构。本实验结果也显示1.5 W的Er,Cr:YSGG激光可以有效清除SLA钛表面牙龈卟啉单胞菌生物膜。

然而本实验存在一定的局限性，所制备的牙龈卟啉单胞菌生物膜并不能完全模拟种植体周围炎时种植体表面的情况。由于独特的能量分布和激光传输系统的固有差异，不同制造商生产的Er,Cr:YSGG激光设备的最佳能量输出会有所不同。临床使用过程中应更好地了解不同激光设备的特性差异，使用最佳激光参数安全有效地进行种植体周围炎的治疗。