基于网络药理学探讨半夏-厚朴药对治疗癫痫的作用机制研究

杨燕， 任娟， 汪泽， 曹永军， 王朝群， 何希瑞

癫痫是由大脑神经元突发性异常放电导致大脑短暂功能障碍的一种慢性疾病。全球约有6 000万左右的癫痫患者，且以每年240万病患人数递增[1]。经2～5年的规范治疗，临床上仍有约30%的患者对现有药物产生了耐药性[2-4]。癫痫患者由于长期大量使用抗癫痫药物，产生诸多不良反应，严重影响生活质量，带来严重经济负担，成为医疗卫生领域的重大难题[5-6]。其中，儿童癫痫的发病机制与形式更为复杂、多样[7]，其治疗成为医疗卫生领域的重大难题。

中医理论认为癫痫证候繁多，病因复杂。归纳起来，可分为痰、火、风、惊、血瘀、外伤等多种病因。其中，痰和火是痫病的主要病因[8]。半夏-厚朴作为相须相使药对，出自《金匮要略》记载的半夏厚朴汤，具有行气散结，降逆化痰之功效。药对中半夏辛温入肺胃，化痰散结，降逆和胃，主要用于痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛等症。据统计，350首中医治疗癫痫的方剂中，半夏位于单味药物使用频率的第四位[9]。厚朴苦辛性温，下气除满，具有化湿导滞、化食消痰、驱风镇痛之效。方中厚朴助半夏散结降逆。研究发现，主要包含半夏和厚朴的组方能显著降低癫痫大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体1 mRNA的表达，上调γ-氨基丁酸受体A基因及γ-氨基丁酸受体的表达[10]。邓中甲教授运用半夏厚朴汤治疗失眠、惊悸、眩晕、胁痛等症属胆郁痰扰者，以及癫痫等症见痰气交阻者的临床效果显著，表明半夏及其配伍在治疗癫痫疾病方面具有研究价值[11]。由于半夏和厚朴配伍后具有多成分、多靶标、多途径等特点，故其抗癫痫的药效物质基础及作用机制较难阐明。

网络药理学是分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶标、多途径”协同作用关系的药理学分支学科，其整体性、系统性等特点与中医药整体观及辨证论治原则一致，为研究中药或复方有效成分、作用靶点、潜在机制等提供有效研究策略[12-14]。鉴于此，本研究基于网络药理学方法，筛选半夏厚朴防治癫痫的主要有效成分、潜在作用靶标，构建“药物-有效成分-靶蛋白-疾病”网络，进行潜在靶标富集分析，探讨其潜在作用机制，为后续的实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库 中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)，Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，小分子数据库PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白质相互作用分析数据库(https://string-db.org/)，蛋白质三维结构数据库(http://www.rscb.org/)，网络分析软件Cytoscape(Version 3.6.0)，化学分子结构软件ChemBioDraw(Version 14.0)，分子对接软件MOE(Version 2019)。

1.2 潜在有效成分数据库的构建 通过TCMSP数据库搜集半夏-厚朴药对化学成分，并结合CNKI数据库中已报道的半夏、厚朴相关文献，构建半夏-厚朴成分数据库。按照口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18为条件进行初步筛选[15-16]，得到半夏-厚朴药对抗癫痫的潜在有效成分。

1.3 “成分-靶点”网络模型的构建 为了阐明半夏-厚朴的防治癫痫的分子机制及其与相关靶点之间的对应关系，本研究利用网络药理学方法对其进行分析，得到半夏-厚朴药对主要有效成分及其关键作用靶点。将1.2中得到的半夏-厚朴潜在有效成分及其对应靶点做成对应的关系表，即C-T.xlsx。然后将该表导入Cytoscape软件，构建“成分-靶点”(C-T)网络模型，分别用不同颜色、形状的节点表示半夏-厚朴药对的潜在有效成分及作用靶点。

1.4 蛋白相互作用网络的构建、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集、生物过程富集分析 为了研究靶点蛋白在整体层面的相互作用，并更好地理解半夏-厚朴药对的防治癫痫的作用机制，将1.3得到的半夏-厚朴药对靶点信息汇总，保存为txt形式文件，并导入STRING在线分析平台中，选取打分值>0.7(高置信度)作为过滤器，得到半夏-厚朴药对的靶点相互作用网络模型，并通过STRING 11.0的Analysis模块进行KEGG富集与生物过程分析。

1.5 分子对接 将网络药理学预测得到的半夏、厚朴潜在有效成分的化学结构转换为sdf格式，并对其进行加氢及能量优化，用于进一步对接。从蛋白晶体数据库(PDB)中下载过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)-α,PPAR-γ的三维晶体结构。用MOE软件对蛋白结构进行结构处理，删除多余水分子，然后进行能量优化。将半夏、厚朴潜在活性化学分子与PPAR-α,PPAR-γ进行对接打分，利用Dock模块进行半柔性对接。对接允许配体分子中化学键旋转，选择打分函数为GBVI/WSA dG。打分函数表征了配体与受体的结合程度，打分值越小，表明配体-受体结合越稳定。

2 结果

2.1 半夏-厚朴药对抗癫痫有效成分 本研究通过系统药理学分析平台、CNKI数据库共收集到半夏、厚朴的化学组分共259个。通过对这些化合物进行口服生物利用度及类药性的分析与筛选，得到潜在有效成分共15个(BX1～BX13，HP1，HP2)。化合物的编号、名称、分子量及参数见表1。

表1 筛选化学成分及口服生物利用度

2.2 半夏-厚朴药对的“成分-靶点”网络模型及其分析 为了解释半夏-厚朴药对的抗癫痫作用机制，将上述15个潜在有效成分通过TCMSP计算平台进行靶点预测与分析，得到半夏-厚朴药对的靶点数55个，其中5个半夏成分(BX4,BX8,BX10,BX12,BX13)没有得到预测靶点信息。通过Cytoscape软件构建半夏-厚朴中10个潜在有效成分与55个靶点之间的“成分-靶点”网络对应关系图，进一步阐明半夏-厚朴抗癫痫作用的关键有效成分、关键靶点及其相互对应关系(图1)。

图1中的“成分-靶点”网络共包含65个节点，分别由10个潜在有效成分和55个靶点组成。如图1所示，“成分-靶点”网络图中分别用不同形式的节点代表半夏-厚朴药对的潜在有效成分及相应的靶点。其中，蓝色菱形节点表示半夏-厚朴药对中经口服生物利用度、类药性筛选得到的潜在有效成分，黄色圆形节点代表潜在有效成分群对应的靶点。在图1中，潜在成分对靶蛋白群的作用程度可以用节点的“度”来刻画，度越高表示该成分能够作用于更多的靶点，即该成分可以更多地参与到有机体的病理或生理过程。类似的分析也可以用于靶点，即靶点的度越高，它与药物作用网络的关系更加密切。进一步对半夏-厚朴药对的“成分-靶点”网络分析发现，黄芩素(BX3)、廿碳-11-烯酸(BX7)、β-谷甾醇(BX5)的中心度较高(黄芩素的中心度为22，廿碳-11-烯酸的中心度为10，β-谷甾醇的中心度为9)。

图1 半夏-厚朴药对的“成分-靶点”网络图

2.3 KEGG通路分析 通过富集分析可以获得靶点基因的相关生物学功能。本研究利用STRING在线分析平台，对半夏-厚朴抗癫痫的关键靶点进行KEGG通路富集分析，发现共有10条代谢通路(图2)，分别是PPAR、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、胆汁的分泌等代谢通路。半夏-厚朴药对参与的生物过程如图3所示，主要有脂肪代谢、类固醇激素代谢、脂肪转运、细胞应答，激素应答，小分子代谢及有机阴离子转运等过程。这些生物过程参与癫痫的发生与发展，同时也受到癫痫疾病发作的影响。对脂肪代谢和类固醇激素代谢途径的干预对难治性癫痫如Dravet综合征和热性惊厥的临床治疗具有重要意义和潜在临床应用价值。

图2 KEGG通路富集分析半夏-厚朴药对有效成分抗癫痫的核心靶标

图3 Biological Process富集分析半夏-厚朴药对有效成分抗癫痫的相关生物过程

2.4 半夏-厚朴药对靶蛋白群相互作用分析 为了研究半夏-厚朴药对与靶蛋白之间的相互关系，我们对其治疗癫痫相关的靶点群进行了蛋白-蛋白相互作用网络构建，得到图4。如图4所示，半夏-厚朴药对治疗癫痫的核心靶点之间存在明显的协同相互作用关系。结合“成分-靶点”作用网络分析可以发现，半夏-厚朴药对抗癫痫的潜在有效成分与核心靶点蛋白之间存在协同效应，这种相互间协同作用改善了大脑的能量代谢和酮体代谢之间的联系，产生协同增效的抗癫痫作用。

图4 作用靶点的相互作用网络

2.5 网络的拓扑分析和模块分析 为了明确半夏-厚朴药对抗癫痫的关键有效成分及主要的作用靶点，本研究筛选到的潜在有效成分及其对应的靶点进行网络拓扑分析。在得到的“成分-靶点”网络基础上，进一步利用Cytoscape软件中的Network Analysis模块对网络进行拓扑分析，获取拓扑参数。网络中节点的中心度可以用节点与节点之间相互作用的路线数目来表征。例如，节点中心度等于1表示该节点只与网络中一个靶点发生相互作用。节点的度越高，其代表的潜在有效成分或靶点在网络中相互作用的参与度越高。表2列出了半夏-厚朴药对中潜在有效成分作用靶点的拓扑参数列表。

表2 “成分-靶点”网络的拓扑分析

2.6 分子对接 本研究采用MOE对接模块的半柔性对接模块对PPAR靶点和半夏、厚朴的潜在有效成分逐一进行分子对接，选取打分排名靠前的化合物表征，打分见表3。本研究选用GBSI/WSA dG函数作为打分函数，该打分函数准确性高，可以更好的评估药物分子与靶点间的结合能。打分函数描述了小分子与靶点间的结合能，其值越低说明配体与受体之间的相互作用越强。从表3可以看出，半夏中成分BX7，BX9，BX10与PPAR-α的对接打分分别为-9.378 3，-9.315 5，-9.076 9，与对照药打分值(-9.654 9)相近，说明半夏中这些有效成分与PPAR-α有较强的相互作用，可能是半夏发挥药理作用的靶点之一。同时，半夏中成分BX7，BX10与PPAR-γ的打分值为-8.923 7，-8.768 6，与对照药打分(-9.099 1)接近，说明这些化合物可能半夏抑制PPAR活性的成分。图5和图6分别显示了半夏有效成分BX8与PPAR-α和PPAR-γ间的相互作用。PPAR-α的Cys276、Met330、Met335与BX8形成3对氢键，稳定了BX8与PPAR-α的相互结合。另外，PPAR-γ的Tyr473、His323、Arg288也可以与BX8形成3对氢键，从而稳定它们之间的相互作用。

表3 半夏-厚朴药对有效成分-核心靶点分子对接

图5 半夏-厚朴药对有效成分BX8-核心靶点分子PPAR-α(PDB:3VI8)对接模式图

图6 半夏-厚朴药对有效成分BX8-核心靶点分子PPAR-γ(PDB:3VJH)对接模式图

3 讨论

癫痫影响全球1‰～2‰的儿童和0.5‰～1‰的人口。尽管诊断准确且使用抗癫痫药物进行了规范治疗，仍有大约30%的癫痫患者未得到有效治疗或对现有药物产生了耐药性，严重威胁着人类的健康[1-2,7-8]。研发安全高效的新型抗癫痫药物是癫痫学界研究的热点和难点问题[3-4]。明代《医学纲目·癫痫》将癫痫总结为“痰邪逆上也，孔窍不通，故耳不闻声，目不识人，而昏眩倒仆也”，认为癫痫病以痰为主，每由风、火触动。中医药治疗癫痫具备多组分、多靶点、整体调节且不良反应少的优势，可有效提高患者的生活质量。半夏厚朴汤出自《金匮要略》，是治疗情志不畅，痰气互结所致梅核气的常用方。方中君药半夏苦辛温燥，化痰散结，降逆和胃，臣药厚朴苦辛而温，行气开郁，下气除满。两药为伍，行气滞化痰结，共奏降逆化痰之功。近年来，实验研究或临床观察均证实半夏及半夏-厚朴药对对癫痫具有一定的疗效[10-11]，但对其抗癫痫的主要有效成分与作用机制尚不明确。本研究利用网络药理学对半夏-厚朴药对抗癫痫的有效成分和作用机制进行预测，发现半夏-厚朴药对抗癫痫的主要有效成分为黄芩素、黄芩苷、松柏苷、(E)-11-二十烯酸和桉叶油醇等。其中，化合物黄芩素和黄芩苷均被报道具有明显的抗癫痫作用。特别是，黄芩苷可显著抑制氯化锂-匹罗卡品、戊四唑、红藻氨酸致癫痫模型动物癫痫发作次数，提高海马神经元自噬活性、减少神经元的凋亡与坏死，从而减轻癫痫所致大脑损伤[17-18]。临床研究显示，黄芩苷可显著降低癫痫患者血清S100β和神经元特异性烯醇化酶含量，降低大脑神经损伤，防止癫痫发作[19]。松柏苷的结构与司替戊醇较类似，后者是临床上用于治疗2岁及以上服用氯巴占的患者与Dravet综合征相关的癫痫发作[20-22]。半夏-厚朴药对中其他几个抗癫痫有效成分的抗癫痫活性研究尚处于空白阶段。

通过KEGG通路富集分析，发现半夏-厚朴药对共有10条代谢通路，分别是PPAR、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、胆汁的分泌、细胞间隙连接、叶酸合成、脂肪的消化与吸收等代谢通路。其中，半夏-厚朴药对对PPAR信号通路的影响最为显著。PPAR可通过调节氧化应激、炎症反应、脑源性神经营养因子/酪氨酸激酶受体B或能量代谢在癫痫发作中发挥保护作用，是治疗癫痫最重要的药物靶标之一[23-24]。动物实验表明，PPAR-α或PPAR-γ选择性激动剂可显著提高癫痫发作阈值，提示PPAR可能参与了癫痫的控制[23]。类固醇激素作为治疗癫痫的药物之一，对其中一部分难治性癫痫具有良好疗效[25-27]。特别是神经类固醇激素如性激素和皮质激素与突触可塑性关系密切，参与癫痫的发病，也受癫痫发作的影响[27]。花生四烯酸代谢通路与炎症发生发展关系密切，而炎症介质可能既是癫痫的并发症，也是某些癫痫发生的内在诱因。如颞叶癫痫和皮质发育不良导致的癫痫患者脑组织中存在白细胞介素-1β、白细胞介素-1受体1、白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等大量的炎症介质[28-29]。脂肪的消化与吸收代谢通路与癫痫发生发展具有很高的关联性。脂肪分解代谢产生的酮体在Dravet综合征和热性惊厥模型中显示出显著的抗癫痫作用，其可通过抑制谷氨酸能突出传递，激活ATP敏感钾离子通道等途径发挥抗癫痫活性[30]。本研究显示，半夏-厚朴药对通过影响这些与癫痫相关的代谢通路而发挥多靶标、多通路的协同增效作用。“成分-靶点”网络显示半夏-厚朴药对有效成分治疗癫痫的主要靶标有PPAR，细胞色素P450 19A1、睾丸特异性雄激素结合蛋白等。考虑到PPAR是生酮饮食疗法治疗难治性癫痫的重要机制之一，实验选择其作为核心靶标，通过分子模拟对接技术发现半夏-厚朴药对关键有效成分与PPAR-α存在较强的相互作用关系。因此，未来针对半夏-厚朴药对抗癫痫相关活性及机制研究，可优先从PPAR着手。

综上，本研究结果初步验证和阐释了半夏-厚朴药对抗癫痫的有效成分和分子作用机制，发现半夏-厚朴药对在治疗癫痫方面显示出较强的临床应用价值。半夏-厚朴药对治疗癫痫呈现多成分、多靶点、多通路的特性，阐释了中药配伍相须相使、协调增效的科学内涵，为半夏-厚朴药对的临床应用提供理论参考，为后续深入研究半夏-厚朴药治疗癫痫的物质基础、有效成分的二次开发及药理作用机制提供了思路和借鉴。