采用气相色谱测定饲料中丙酸的含量

高俊峰，黄 婷，刘小敏

(国粮武汉科学研究设计院有限公司//国家饲料质量监督检验中心(武汉)，湖北 武汉 430079)

丙酸为无色透明液体，属于一种强极性酸性化合物，易溶于水；丙酸盐包括丙酸钠、丙酸钙、丙酸钾等[1]。丙酸及丙酸盐都是酸性防霉剂，具有较广的抗菌谱，对霉菌、真菌、酵母菌等都有一定的抑制作用，其毒性很低，是动物正常代谢的中间产物，也是饲料工业中应用最广泛的防霉剂[1]。

饲料中丙酸的提取主要以蒸馏法为主，但由于饲料基质复杂，在水蒸汽蒸馏过程中某些饲料中的高淀粉原料易糊化，因此导致饲料中的丙酸无法完全提取，影响测定结果，因此必须优化试验的前处理条件。国内外关于丙酸、丙酸盐类分析方法的报道较多，有气相色谱法(GC)、气质联用色谱法(GC-MS)、薄层色谱法、电位滴定法、毛细管电泳法等[2-6]。薄层色谱法、电位滴定法、毛细管电泳法由于其灵敏度、精密度以及分析速度均不理想，故很少用于饲料中丙酸(丙酸盐)的测定。气质联用色谱法虽然特异性高、抗干扰能力强，但使用成本昂贵。因此，本试验采用气相色谱法作为试验方法。参考GB/T 17815—1999《饲料中丙酸、丙酸盐的测定》[7]，发现该标准制订年限较早，受当时技术条件限制，使用的是载量低的玻璃填充柱，方法中无检出限和定量限。本试验采用目前主流的石英毛细管柱。通过对试样前处理条件、气相色谱柱的优化，发现该法具有便利性高、灵敏度高、重复性好的优点，可满足不同种类饲料中丙酸的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Trace1310气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器和Chromeleon7数据处理系统，美国赛默飞世尔公司；0.1 mg电子天平，梅特勒托利多公司；纯水机，美国赛默飞世尔公司；全玻璃蒸馏装置(具500 ml蒸馏瓶)。

丙酸标准品(CAS号79-09-4，纯度≥97.0%)，北京坛墨质检标准物质中心；硅油、优级纯磷酸、分析纯石英砂、分析纯氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲酸，天津科密欧化学试剂公司；0.45 μm水溶性滤膜，天津津腾实验设备有限公司；饲料样品，国家饲料质量监督检验中心(武汉)。

1.2 标准溶液配制

准确称取1.031 0 g丙酸标准品(精确至0.1 mg)，以超纯水为溶剂，配制成10 mg/ml的标准贮备液，于4℃保存。移取标准贮备液适量，用超纯水稀释到1 mg/ml作为标准工作液，临用现配。

1.3 仪器条件

Agilent DB-WAX石英毛细管柱(柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚度0.5 μm)，美国安捷伦科技公司；载气流速：1 ml/min；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温箱温度：110℃保持5 min，然后以10℃/min的速率升到180℃，保持5 min；分流比：5∶1；进样量：1 μl。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

针对某些饲料在水蒸汽蒸馏过程中易糊化的缺点，本试验加入过量的氯化钠、适量的石英砂防止饲料结块，从而提高蒸馏效率和结果的准确性。

准确移取10 mg丙酸标准溶液置于蒸馏装置中，进行水蒸汽蒸馏并测定回收率，以此来比较不同条件下的蒸馏提取效果。结果见表1。

表1 不同蒸馏条件对丙酸回收率的影响

同时，研究了蒸馏馏出液体积对测定的影响，按本次试验规定的条件进行水蒸汽蒸馏，测定回收率，结果见图1。

图1 蒸馏体积对丙酸回收率影响

由表1和图1最终确认前处理优化步骤如下：准确称取50 g试样(精确至0.1 g)置于500 ml的蒸馏瓶中，迅速加入200 ml水，80 g氯化钠，10 ml 50%磷酸溶液，10 g石英砂及2～3滴硅油，立即进行水蒸汽蒸馏；将250 ml容量瓶置于冰水浴中作为吸收液装置，放置直至馏出液接近240 ml。在室温下放置30 min，加1.0 ml 2%甲酸溶液，充分摇匀后定容,用0.45 μm滤膜过滤待测。

2.2 方法的线性范围

丙酸溶液标准气相色谱图见图2。

图2 丙酸标准溶液气相色谱图(c=100 μg/ml)

采用空白基质添加标准溶液提取法绘制标准曲线。分别取1.2中适量的标准工作液置于500 ml蒸馏瓶中，按照2.1优化后的前处理条件进行蒸馏提取，得到质量浓度分别为5.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 μg/ml的丙酸标准溶液。以丙酸浓度为横坐标，丙酸色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，在质量浓度5.0～400.0 μg/ml时，线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.999。

2.3 方法的检出限与定量限

根据GB/T 27417—2017《合格评审化学分析方法确认和验证指南》关于检出限和定量限描述[8]，本试验中丙酸的可视最低检出浓度为5.0 μg/ml，可视可靠最低检出浓度为20.0 μg/ml。依据2.1中的称样量和稀释体积得出检出限为30 mg/kg，定量限为100 mg/kg。

2.4 方法的加标回收试验

不同种类饲料丙酸的添加回收率见表2。

表2 不同种类饲料丙酸的添加回收率(n=5)

选用谷物类原料(玉米、小麦)、发酵类(DDGS)、蛋白类(豆粕、肉粉、鱼粉)、配合饲料(猪、鸡、鱼配合饲料)、浓缩饲料(猪浓缩饲料)为测试对象，进行加标回收试验，每批次内同一浓度做5次平行试验。

从表2数据中可以看出，丙酸加标平均回收率为84.3%～99.81%，RSD为0.62%～4.81%。该法能适应饲料原料、植物蛋白饲料、配合饲料、浓缩饲料等各种饲料中丙酸的测定。

2.5 方法的重复性试验

为考察方法重复性，选用谷物类原料(玉米)、蛋白类(豆粕)、配合饲料(猪配合饲料)、浓缩饲料(猪浓缩饲料)为测试对象，不同实验室用同一样品进行试验，每批次同一浓度做5次平行试验，以此来考察方法的重复性，结果见表3。

表3 不同实验室对同批次不同丙酸添加水平测定结果的统计

通过分析不同实验室对不同丙酸含量测试结果，方法的重复性≤10%，再现性≤15%，方法精密度满足要求。

2.6 方法的应用

从市场上抽取添加商品名为“露保西盐”的防霉剂饲料样品若干，利用上述方法对其进行测定，检测结果见表4。

表4 商品饲料中丙酸的测定结果

“露保西盐”主要成分是丙酸钙，其标签中注明丙酸含量为60%左右，从表4的结果可以看出，检测值与标签值测定结果在误差范围内。

3 结论

本试验为饲料中丙酸的测定提供了一种新的思路，通过对前处理条件和色谱柱的优化，达到了操作简便、检测灵敏度高的目的，具有一定的实用推广价值。