福氏志贺菌来源L-鼠李树胶糖激酶的克隆表达及酶学性质分析

冯林雪，陈洲，王亚森，冯康，许向阳，李子杰*，中西秀树*，高晓冬

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)2(枣庄市杰诺生物酶有限公司，山东 枣庄，277100)

D-阿洛酮糖是一种稀有糖[1]，是D-果糖的C-3差向异构体，主要来源于少部分植物和细菌。D-阿洛酮糖除具有低能量、改善肠道菌群、抗龋齿等生理功能[2-4]外，还在抑制血糖升高与体脂积累、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要生理活性作用[5-10]。D-阿洛酮糖甜度可达到果糖的70%[11]，能量只有蔗糖的0.3%[12]，是一种新型甜味剂[13-15]，尤其适用于糖尿病及肥胖症人群[16]。目前其生产主要依赖生物转化法，即以D-果糖为底物，在D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)的催化作用下将D-果糖转化为D-阿洛酮糖[17-18]，但该反应转化率低，约为30%。为了提高转化率，WEN等[19]建立了一种“磷酸化-脱磷酸”级联反应，即将DPE与L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase，RhaB)偶联，利用RhaB催化D-阿洛酮糖为D-阿洛酮糖1-磷酸，后者再通过磷酸酶将D-阿洛酮糖1-磷酸脱磷酸为D-阿洛酮糖，通过该级联反应可大大提高D-阿洛酮糖的转化率。

RhaB属于己糖激酶-肌动蛋白-hsp70家族的一种[20]，在N端及C端都有5股β折叠，在它们的间隙处有ATP结合位点[21-27]。RhaB可以磷酸化C-3构型为R型的稀有糖，但对C-3构型为S构型的糖无活性[19]。近年来，RhaB被用于D-阿洛酮糖的生产，通过RhaB的引入，可大大提高D-阿洛酮糖的转化率[19, 28-30]。

鉴于目前对于RhaB的研究较少且其在D-阿洛酮糖合成中有重要应用，本研究从福氏志贺菌(Shigellaflexneri2a str.301)的基因组DNA中克隆得到了rhaB基因(Gene ID：1025156)并对其进行改良，对突变体酶学性质进行了一系列分析。将RhaB与D-阿洛酮糖进行分子对接，初步研究了RhaB的催化机制，为其在D-阿洛酮糖生产方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌EscherichiacoliXL10-gold、BL21(DE3)及福氏志贺菌(Shigellaflexneri2a str.301)基因组，本实验室保存；菌株BL21(DE3)/pET28a-rhaB、菌株BL21(DE3)/pET28a-rhaBE437Q，本研究构建。

1.1.2 酶试剂及耗材

PCR所需试剂(Prime STAR)、限制性内切酶，宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；PCR所需试剂(KOD FX Neo)，日本东洋纺公司(TOYOBO)；ATP、D-果糖，上海生工生物公司；卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、标准蛋白试剂盒(12 000～200 000 Da)，Sigma-Aldrich公司；Ni2+亲和层析柱，GE公司；各种稀有糖，TCI(上海)化成工业发展有限公司；薄层色谱(thin-layer chromatography，TLC)薄层层析板60 F254，德国默克公司；Sugar-PakTM色谱分析柱(300 mm×6.5 mm)，美国Waters公司。

1.1.3 培养基及其他溶液的配制

LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5，琼脂粉20(固体培养基)，高压蒸汽灭菌(121 ℃，15 min)。

TB培养基：酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油体积分数为0.4%，K2HPO412.53 g/L，KH2PO42.31 g/L，营养成分和盐分开高压蒸汽灭菌(121 ℃，15 min)后混匀。

蛋白纯化缓冲液：裂解、平衡缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl；洗涤缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，60 mmol/L咪唑；洗脱缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑；脱盐缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L NaCl。

1.1.4 仪器与设备

AG 22331 Hamburg PCR仪，德国Eppendorf公司；PAC300电泳仪Bio-Rad Power，美国伯乐公司；E2695 HPLC，美国Waters公司；VCX 750超声波细胞粉碎机，南京新辰生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组质粒的构建

采用Prime STAR聚合酶进行PCR 时，以福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)基因组为模板，以rhaB-F:GCGCGGATTCATGACCTTTCGCAATTGTGT(BamH Ⅰ)为上游引物，以rhaB-R:ATATCCATGGTCATGCGCAAAGCTCCTTTG(Hind Ⅲ)为下游引物进行PCR得到目的基因，目的基因与pET28a载体经双酶切后将载体与目的基因用DNA连接酶Ligation-mix于25 ℃静置20 min连接。将连接产物转化至大肠杆菌XL10-gold感受态细胞，置于冰上25 min，42 ℃热激40 s，冰上放置3 min后将转化产物涂布至LB[卡那霉素(kanamycin,Kan)](50 μg/mL)平板。挑取阳性克隆进行菌落PCR及双酶切验证最后送测序。pET28a-rhaBE437Q的构建所用PCR试剂为KOD FX Neo，以pET28a-rhaB为模板，以RhaBE437Q-F:GGCAATATCGGCATCCAGTTAATGACGCTGGAT为上游引物，以RhaBE437Q-R:ATCCAGCGTCATTAACTGGATGCCGATATTGCC为下游引物进行PCR，用去甲基化酶DpnⅠ消化掉PCR产物中的模板质粒后转化至大肠杆菌XL10-gold感受态细胞，提取质粒并测序。

1.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将上述测序成功的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Kan)(50 μg/mL)平板37 ℃过夜培养。挑取单菌落接种至5 mL LB(Kan)(50 μg/mL)培养基37 ℃培养过夜，后以1%接种量转接至200 mL TB(Kan)(50 μg/mL)培养基，37 ℃振荡培养2 h左右待OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG转入16 ℃诱导表达20 h，收集菌体置于-20 ℃备用(分别取500 μL诱导前及诱导后菌体用于后续SDS-PAGE检测)。

1.2.3 重组蛋白的分离纯化

将菌体重悬于预先预冷的装有10 mL裂解缓冲液的50 mL离心管中，冰上超声破碎，破碎2 s，间歇2 s，总时间30 min，显微镜下观察菌体是否破碎。将破碎液于低温条件下进行高速离心，得到的上清液和沉淀分别取样，上清液用于蛋白的纯化。采用Ni2+亲和层析的方法进行纯化(5 mL HisTrpTMHP)，纯化步骤如下：(1)用30 mL无菌水清洗柱子；(2)10 mL 0.1 mol/L的NiSO4再生柱子；(3)20 mL无菌水洗去未结合的Ni2+；(4)20 mL平衡缓冲液平衡柱子；(5)缓慢上样，使蛋白与柱子充分结合；(6)20 mL平衡缓冲液洗去未结合的蛋白；(7)20 mL低浓度咪唑洗去结合能力较弱的杂蛋白；(8)20 mL高浓度咪唑洗去目标蛋白并收集。收集到的蛋白含有较多盐，因此将蛋白进行脱盐处理。将收集到的目标蛋白用超滤管(10 kDa)进行浓缩(3 600×g，4 ℃离心一定时间)，加入脱盐缓冲液，浓缩到一定体积后加入终体积分数为10%的甘油并测浓度，后分装为小管置于-20 ℃保存。

1.2.4 重组蛋白RhaB的氨基酸序列分析

将福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)来源的RhaB蛋白(RhaB-Sf2a str.301，蛋白ID NP_709708)与福氏志贺菌(S.flexneri)来源的RhaB蛋白(RhaB-Sf，蛋白ID WP_039062492.1)，大肠杆菌(E.coli)来源的RhaB蛋白(RhaB-E.coli，蛋白ID WP_000144054.1)通过CLC Sequence viewer进行序列比对。

1.2.5 重组蛋白RhaB及RhaBE437Q活性的测定

整个酶反应体系体积为250 μL，其中底物D-阿洛酮糖5 g/L，MnSO45 mmol/L，ATP 27 mmol/L，重组蛋白0.2 mg/mL，50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl补足至250 μL。37 ℃反应10 min，100 ℃加热10 min终止反应。取0.5 μL反应液进行TLC检测，展开剂为V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶1∶1的混合液。用茴香醛染色检测D-阿洛酮糖1-磷酸的生成。取余下反应液离心(15 000 r/min，10 min)，取上清液过0.22 μm 滤膜进行HPLC检测，通过检测反应中D-阿洛酮糖的减少量来定义酶活性。检测条件为：Sugar-PakTM色谱柱，流动相为500 mg/L的EDTA钙盐，流速为0.5 mL/min，柱温为80 ℃，示差检测器。

1.2.6 重组蛋白(RhaBE437Q)分子质量的检测

采用SDS-PAGE(5%浓缩胶、10%分离胶)进行重组蛋白单亚基分子质量的测定，考马斯亮蓝染色。采用凝胶过滤层析检测整体的蛋白分子质量，检测条件：TSK G3000SWXL凝胶柱，流动相为PBS溶液，流速为0.5 mL/min，紫外检测器，检测波长为280 nm。

1.2.7 重组蛋白(RhaBE437Q)最适反应条件的测定

整个酶反应体系体积为250 μL，其中底物D-阿洛酮糖5 g/L，MnSO45 mmol/L，ATP 30 mmol/L，重组蛋白RhaBE437Q0.2 mg/mL，50 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl补足至250 μL。不同温度条件下反应5 min，100 ℃ 加热10 min终止反应，检测反应后D-阿洛酮糖的减少量。采用不同pH的缓冲液进行最适pH的测定，其中pH 6～7为磷酸盐缓冲液，pH 7～8.5为Tris-HCl缓冲液，pH 8.5～10为Gly-NaOH缓冲液。测定最适金属离子时，先将重组蛋白RhaBE437Q用含有50 mmol/L EDTA的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)溶液透析12 h以除去金属离子，然后再用不含EDTA的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)溶液透析12 h除去EDTA，选用Zn2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+7种离子及EDTA测定酶活性。

1.2.8 重组蛋白(RhaBE437Q)底物特异性的测定

以不同稀有糖为底物(D/L-果糖，D/L-阿洛酮糖，D/L-山梨糖，D/L-塔格糖)，酶反应体系同酶活性测定，40 ℃反应5 min，HPLC检测糖的减少量，对D-阿洛酮糖的活性定义为100%，测定重组蛋白RhaBE437Q对D-阿洛酮糖的活性以及对其他糖的相对活性。

1.2.9 重组蛋白RhaBE437Q对D-阿洛酮糖催化机理的分析

采用SWISS-MODEL 在线程序(https://swissmodel.expasy.org/)，以大肠杆菌来源RhaB为模板(PDB：2cgl.1.A，同源性98.57%)同源建模得到RhaBE437Q蛋白结构模型。后将D-阿洛酮糖与重组蛋白RhaBE437Q蛋白结构模型利用AutoDock软件[31]进行分子对接，利用Pymol分析其催化机理。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白RhaB的氨基酸序列分析

序列比对(图1)显示，2种福氏志贺菌来源RhaB-Sf2a str.301与RhaB-Sf的氨基酸序列具有高度保守性，仅在437号氨基酸位点存在差异。RhaB-Sf2a str.301 第437号位点氨基酸为谷氨酸(E)，而RhaB-Sf该位点氨基酸为谷氨酰胺(Q)，且大肠杆菌来源RhaB-E.coli该位点氨基酸也为谷氨酰胺(Q)，因此将RhaB-Sf2a str.301第437号氨基酸位点的谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)。

2.2 重组蛋白RhaB、RhaBE437Q的表达纯化

RhaB、RhaBE437Q理论等电点(isoelectric point，pI)和分子质量(Mw)分别为pI 5.03/54 050.04 Da(RhaB)，pI 5.08/54 049.05 Da(RhaBE437Q)(www.Expasy.Org)。由SDS-PAGE结果(图2)可知，经IPTG诱导后，RhaB、RhaBE437Q蛋白在50～70 kDa均有清晰的目的条带，因此二者在大肠杆菌中均成功表达。与RhaB蛋白相比，RhaBE437Q蛋白更多的以可溶性蛋白的方式存在；而RhaB蛋白大多以包涵体形式存在，仅存在极少部分的可溶性蛋白。

2.3 重组蛋白RhaB、RhaBE437Q的活性检测

以D-阿洛酮糖为底物，RhaB蛋白可将D-阿洛酮糖磷酸化生成D-阿洛酮糖1-磷酸。由于D-阿洛酮糖和其磷酸糖极性相差较大，因此可通过TLC来检测。TLC结果如图3所示，大肠杆菌来源的RhaB蛋白催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛酮糖1-磷酸，在D-阿洛酮糖下方可看到清晰的磷酸糖的点(如图3中箭头所示)；而福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)来源的RhaB蛋白对D-阿洛酮糖几乎无活性，从TLC图(图3-a)看不到磷酸糖的生成；而RhaBE37Q蛋白与大肠杆菌来源的RhaB蛋白相比，可看到几乎相同量磷酸糖的产生(图3-b)。同时通过HPLC检测D-阿洛酮糖的减少量(图4)，发现突变体蛋白活性为未突变蛋白的10倍。因此推测福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)来源的RhaB蛋白第437号位点氨基酸是影响其表达及活性的关键氨基酸。

M-蛋白Marker；1-诱导前全细胞；2-诱导20 h的全细胞； 3-细胞裂解液上清液；4-细胞裂解沉淀；5-纯化后蛋白 a-突变前；b-突变后图2 SDS-PAGE检测重组蛋白RhaB/RhaBE437Q的表达和纯化Fig.2 SDS-PAGE analysis of RhaB/RhaBE437Q expression and purification

1-D-阿洛酮糖标样；2-大肠杆菌来源RhaB蛋白催化 D-阿洛酮糖反应液；3-福氏志贺菌来源RhaB/RhaBE437Q 蛋白催化D-阿洛酮糖反应液 a-RhaB；b-RhaBE437Q图3 TLC检测RhaB及RhaBE437Q蛋白活性Fig.3 TLC analysis of the activities of RhaB and RhaBE437Q 注：图中箭头所指表示磷酸糖(图7同)

1-反应前；2-RhaB反应5 min；3-RhaBE437Q反应5 min图4 HPLC检测RhaB及RhaBE437Q蛋白活性Fig.4 HPLC analysis of the activities of RhaB and RhaBE437Q

2.4 重组蛋白RhaBE437Q分子质量的确定

通过SDS-PAGE可知RhaBE437Q蛋白单个亚基分子质量约为54 kDa(图2-b)，整体蛋白分子质量通过凝胶柱(TSK G3000SWXL)分析计算可知约为58 kDa(图5)，因此福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)来源的RhaBE437Q与大肠杆菌来源的RhaB蛋白[32]一样，均为单体蛋白。

2.5 金属离子、温度、pH对重组蛋白RhaBE437Q活性的影响

金属离子、温度、pH对于酶促反应具有重要影响。由图6-a可知，Mn2+对反应的促进作用最为明显。除Mn2+和Mg2+外，其余金属离子对酶催化几乎无促进作用。根据文献报道，大肠杆菌来源的RhaB最适反应温度为35 ℃，最适pH值为8.0[29]。在10～60 ℃，测定重组蛋白RhaBE437Q的最适反应温度，结果如图6-b所示，重组蛋白RhaBE437Q的最适反应温度为40 ℃；在20～50 ℃，重组蛋白RhaBE437Q仍保留50%以上的活性；但当温度超过40 ℃时，酶活性降低较为明显，说明随着温度升高，温度对酶结构影响较大，是影响酶活性的主要因素。在pH 6～10测定反应的最适pH，由图6-c可知，反应的最适pH值为8.5，且在该范围内重组蛋白RhaBE437Q均可保持60%以上的酶活性，说明重组蛋白RhaBE437Q有较宽泛的pH耐受性。

图5 RhaBE437Q蛋白分子质量的测定Fig.5 Gel filtration chromatography analysis of RhaBE437Q′s molecular mass注：标准蛋白包括葡聚糖(2 000 kDa)，β-淀粉酶(200 kDa)， 乙醇脱氢酶(150 kDa)，碳酸酐酶(29 kDa)，细胞色素c(12.4 kDa)

a-金属离子；b-温度；c-pH图6 金属离子、温度、pH对RhaBE437Q活性的影响Fig.6 Effect of metal ions, temperature and pH on the activity of RhaBE437Q

2.6 重组蛋白RhaBE437Q底物特异性的分析

以不同的稀有糖为底物，通过TLC检测磷酸糖的产生来分析重组蛋白RhaBE437Q的底物特异性。由TLC结果可知(图7)，重组蛋白RhaBE437Q与D-阿洛酮糖、L-果糖、D-山梨糖、L-塔格糖反应均有磷酸糖的产生(如图7中黑色箭头所示)，而与L-阿洛酮糖、D-果糖、L-山梨糖、D-塔格糖反应无磷酸糖产生。与文献报道一致，RhaB蛋白只能催化C-3构型为R构型的稀有糖[20]。经HPLC检测反应中糖的减少量，对D-阿洛酮糖活性定义为100%，则L-果糖、D-山梨糖、L-塔格糖的相对活性分别为76%、77%、102%。

1-D-果糖；2-D-阿洛酮糖；3-L-阿洛酮糖； 4-L-果糖；5-D-山梨糖；6-L-塔格糖； 7-L-山梨糖；8-D-塔格糖图7 TLC检测RhaBE437Q底物特异性Fig.7 TLC analysis of substrate specificity of RhaBE437Q

2.7 重组蛋白RhaBE437Q对D-阿洛酮糖催化机理的分析

RhaBE437Q蛋白结构模型和D-阿洛酮糖分子对接结果如图8所示，该模型可清晰的看出RhaBE437Q的结构，ADP、PO3及底物D-阿洛酮糖的位置。重组蛋白RhaBE437Q在N端及C端都有β折叠，ADP位于其间隙处。PO3为ATP结合位点，位于ADP和D-阿洛酮糖之间。底物D-阿洛酮糖位于蛋白的中心。437号氨基酸突变位点虽远离活性中心及底物结合口袋，但对蛋白质的表达及活性产生了很大影响，类似于XIE等[33]对辛伐他汀合酶的改造结果。推测该位点为暴露在溶剂中的氨基酸位点，突变后降低了蛋白质的聚合作用，改善了蛋白质的错误折叠，因此改变了蛋白质的表达水平及活性。由图9可知，底物D-阿洛酮糖与RhaBE437Q结合位点周围的氨基酸有Gly83、His236、Asp237、Thr238、Trp260、Asn296。底物D-阿洛酮糖与重组蛋白RhaBE437Q的Gly83、His236、Asp237、Thr238氨基酸形成氢键，同时，底物D-阿洛酮糖与重组蛋白RhaBE437Q在Phe134、Glu284、Leu132、Trp82、Leu262位点之间有范德华力的产生。但范德华力与氢键相比作用力较弱，因此主要的分子间相互作用仍为氢键。这些氨基酸可能在酶与底物的结合和催化过程中起着重要作用，可为进一步饱和突变验证酶活性中心关键残基提供指导。

图8 重组蛋白RhaBE437Q与D-阿洛酮糖的对接模型Fig.8 The overall position model of D-allulose binding on RhaBE437Q

a-D-阿洛酮糖与重组蛋白RhaBE437Q之间氨基酸残基三维谱图； b-D-阿洛酮糖与重组蛋白RhaBE437Q之间相互作用力二维谱图图9 重组蛋白RhaBE437Q与D-阿洛酮糖的结合位点Fig.9 Binding site of D-allulose on RhaBE437Q

3 结论

从福氏志贺菌(S.flexneri2a str.301)中克隆得到了rhaB基因，对其进行定点突变得到rhaBE437Q基因，并成功在E.coliBL21(DE3)中进行表达，利用镍离子亲和层析柱对突变体蛋白进行纯化，发现突变体蛋白可溶性及活性均得到很大改善。研究了突变体蛋白的酶学性质：突变蛋白为单体；其最优反应条件为40 ℃，pH 8.5，Mn2+；突变体蛋白对C-3构型为R构型的糖有催化作用；将其与底物D-阿洛酮糖进行分子对接，酶活性中心Gly83、His236、Asp237、Thr238等残基与D-阿洛酮糖间存在氢键作用，推测是影响酶催化的关键残基，可进行进一步突变验证。重组蛋白RhaBE437Q的研究可为工业化生产D-阿洛酮糖提供更多方法。