广西扶绥酸粥中微生物组成及营养成分分析

任宇婷，陈春利，朱永亮，郭昊翔，陈忠军，孙子羽，满都拉

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特，010018)

酸粥是我国传统发酵食品之一，食用历史源远流长，在内蒙古西部、晋西北地区、广西崇左、扶绥等地区皆有食用。不同地区酸粥的做法及原料不同，内蒙酸粥和晋西北酸粥是以糜米、大米、小米、江米等谷物和水为原料，经1～2 d自然发酵而成[1]。广西酸粥是以冷米饭或放凉的大米粥为原料，放入陶罐中经7～8 d自然发酵而成[2-3]。当有剩余米饭时，会及时加入陶罐中与之前发酵好还未食用的酸粥一起进行发酵，因此每个家庭的酸粥原料一致，酸粥的发酵时间及状态无法确定。不同于北方地区的酸粥，广西酸粥是浓稠的稀粥，越白越细稠的酸粥质量越好，味道越鲜美[4]。广西酸粥可以用来做配菜，也可炒熟后直接食用，不仅味道独特还具有爽口开胃的功能，备受当地居民的喜爱[3-4]。

酸粥作为备受欢迎的地方特色食物，具有丰富的微生物和较高的营养价值。近年来，研究人员采用纯培养技术和高通量测序技术对北方地区的酸粥微生物多样性进行研究，发现内蒙酸粥及晋西北酸粥中主要微生物是乳酸菌、醋酸菌和酵母[1,5-9]。同时研究发现，北方地区酸粥中含有蛋白质、脂肪、氨基酸、有机酸、维生素、钙、磷、酚类等营养物质，其中有机酸、维生素含量随发酵时间增长而增加，与未发酵的谷物相比，发酵酸粥中氨基酸含量较多[1,10-12]。因此认为酸粥具有很强的营养保健功能，是一种对人体健康有益的食品。

目前对内蒙酸粥和晋西北酸粥均有相关研究，但有关广西地区酸粥中微生物多样性和营养成分的研究鲜有报道。因此，本研究以广西崇左市扶绥县酸粥为研究对象，采用高通量测序技术和理化分析方法对样品中的细菌和真菌群落结构及营养成分进行分析，加强对广西酸粥的认识，同时为传统发酵酸粥进一步开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

样品于2018年12月采集自广西壮族自治区崇左市扶绥县(图1)，编号为1，2，3，4，5，6。所采集的6个酸粥样品来自6户不同的家庭，制作酸粥所使用的原料均为冷米饭，由于酸粥制作中不断的添加新的冷米饭，因此未能确定酸粥发酵时间及状态。

图1 酸粥样品照片Fig.1 Photos of sour porridge

1.2 实验方法

1.2.1 微生物高通量测序与数据分析

使用FastDNA®Spin Kit for Soil(MP Biomedals，U.S.)从样品中提取基因组DNA。使用引物338F和806R对细菌V3～V4区域进行扩增，使用ITS1F和ITS2R对真菌ITS1区域进行扩增。对纯化后的扩增产物进行高通量测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

测序所得数据经FLASH(1.2.11)拼接后，使用UPARSE(7.1)以97%相似度进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)划分。从每个OTU 中选择一条代表性序列，利用RDP(11.5)对序列进行物种分类注释，使用Sliver数据库和Unite数据库对其进行同源性比对分析，分别在门和属水平对各样品的细菌和真菌多样性进行统计分析。使用PICRUSt2(1.1.0)进行细菌功能预测。

1.2.2 样品物理化学指标分析

采用pH计(PB-10)测定pH值；水分测定采用直接干燥法(GB/T 5009.3—2016)；蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)；脂肪含量的测定采用酸水解法(GB/T 5009.6—2016)。

1.2.3 样品中维生素含量测定

取酸粥样品5 mL，加入5 mL灭菌后超纯水并充分混匀，超声提取5 min(20 W处理10 s，间隔15 s)，离心吸取1 mL样品上清液经0.22 μm滤膜过滤，使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies G7192A)进行测定，色谱条件参照任丹丹等[13]的方法。

1.2.4 样品中游离氨基酸含量测定

取酸粥样品5 mL，加入5 mL 5-磺基水杨酸(5%，质量分数)并充分混匀，4 ℃下静置15 min，13 000 r/min 离心20 min，取1 mL上清液加入0.02 mol/L 盐酸，稀释至适当倍数，经0.22 μm过滤器过滤，使用高速氨基酸分析仪测定酸粥中游离氨基酸含量[14-15]。

2 结果与分析

本研究共采集了6个样品，由于未能将样品1，4的基因组提取出来，故只有2，3，5，6样品进行高通量测序，对6个酸粥样品中的化学成分进行分析。

2.1 微生物丰富度和多样性分析

对采集的4个酸粥样品进行高通量测序，16S rRNA V3～V4区域测序共得到230 807条序列，ITS1区域测序共得到266 838条序列。以97%的相似性对测序所得序列的聚类进行OTU划分，细菌有898个OTU，真菌有90个OTU。选取Chao和Shannon指数来描述样品微生物丰富度和多样性，细菌中样品3的Chao指数和Shannon指数最大，说明样品3的细菌群落多样性在所采集测序的样品中最高，物种数最多，相反，样品5的细菌群落多样性最低，物种数最少(表1)。真菌中样品3的Chao指数最大但Shannon指数最小，说明样品3的真菌物种数最多，群落多样性最小，但样品6的真菌群落多样性最大(表2)。本次测序的4个样品的Shannon曲线达到了饱和状态，coverage指数均大于0.99，说明本研究的测序深度合适，能够反应样品中微生物的真实情况(图2)。

表1 样品细菌V3～V4测序结果及多样性指数Table 1 Bacteria V3～V4 sequencing results and diversity index of samples

表2 样品真菌ITS1测序结果及多样性指数Table 2 Fungi ITS1 sequencing results and diversity index of samples

2.2 酸粥中细菌组成研究

从不同的细菌OTU中选择具有代表性的序列，并将其与Sliver数据库进行同源性比对后，细菌OTU被划分为32个门，479个属。在门水平厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)为优势菌门(图3-a)。其中厚壁菌门在所有样品中所占比例均大于60%，在样品5中所占比例高达99%。在属水平乳酸杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)为优势细菌属(图3-b)。乳酸杆菌属在所有样品中所占比例均大于42%，除乳酸杆菌属外，在样品2中还存在大量醋酸杆菌属细菌，在样品6中还存在大量芽孢杆菌属细菌。已报道的内蒙酸粥中[5,16-17]，主要细菌属为乳酸杆菌属和醋酸杆菌属，不同地区酸粥样品中还有假单胞菌属(Pseudomonas)，与本次研究的广西酸粥具有相似性。不同于内蒙及晋西北地区酸粥，在本研究中芽孢杆菌属作为优势细菌属被检测出。由此可以说明不同地区酸粥细菌组成具有一定差异，但主要细菌是乳酸杆菌属和醋酸杆菌属。

a-细菌；b-真菌图2 酸粥细菌Shannon曲线和真菌Shannon曲线Fig.2 The curve of Shannon index of bacteria and fungi in sour porridge

进一步对每个样品中OTU数进行统计并绘制成Venn图(图4)。细菌中仅有6个OTU是所有样品所共有的，占OTU总数的0.67%，占总序列数的52.7%，其中OTU 218(Lactobacillus)、OTU 726(Bacillus)和OTU 279(Leuconostoc)分别占6个OTU总数的80.20%、17.75%和1.42%。但优势细菌醋酸杆菌属在各个样品中所占比例有较大的差异，在样品6中未被检测出。各样品中特有OTU数差别较大，但总序列数小于共有OTU的总序列数。以上研究表明，各酸粥样品中虽含有特有种系，但多数为共有菌群。

2.3 酸粥中真菌组成研究

从不同的真菌OTU中选择具有代表性的序列，并将其与Unite数据库进行同源性比对后，OTU被划分为3个门，39个属。在门水平子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)和unclassified-k-Fungi为优势菌门(图5-a)。在属水平毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、unclassified-p-Ascomycota和德克酵母属(Dekkera)为优势真菌属(图5-b)。毕赤酵母属广泛存在于样品2、样品5及样品6中，在样品3中的丰度仅占4.47%。酿酒酵母属在样品3中丰度最高为93.87%，在样品6中仅为2.89%，在样品2中未被检测出。德克酵母属在样品6中丰度最高为7.25%，在样品3中未被检测出。在样品6中存在一种未被分类的子囊菌门真菌，在其他样品中丰度较低。对内蒙酸粥的研究表明酸粥中真菌门有4种，优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，优势真菌属为假丝酵母属(Candida)和耐碱酵母属(Galactomyces)以及毛孢子菌属(Trichosporon)[8]。内蒙地区酸粥真菌微生物与本文研究的广西酸粥真菌微生物在门水平无较大差异，在属水平具有较大差异。

a-门水平；b-属水平图3 酸粥中优势细菌Fig.3 Dominant bacterial in sour porridge注：平均丰度占比均小于1%的门和属归为others(图5同)

图4 基于OTU水平的细菌Venn图Fig.4 Bacterial Venn diagram based on OTU level

进一步对每个样品中OTU数进行统计并绘制成Venn图(图6)。真菌中仅有2个OTU是所有样品共有的，为毕赤酵母属，序列数占总序列数的4.3%。各样品中特有OTU数较共有OTU数多，但总序列数小于共有OTU总序列数。以上研究表明酸粥中核心真菌种类一致。

a-门水平；b-属水平图5 酸粥中优势真菌Fig.5 Dominant fungi in sour porridge

图6 基于OTU水平的真菌Venn图Fig.6 Fungi Venn diagram based on OTU level

2.4 酸粥营养成分分析

2.4.1 酸粥营养成分分析

对所有酸粥样品测定其pH、水分含量、蛋白含量以及脂肪含量，酸粥样品的pH值为2.64～2.82(表3)，与已研究的内蒙及晋西北地区酸粥pH值具有差异。研究表明内蒙地区及晋西北地区酸粥pH值为3.0～4.5[9,18-19]。QIN等[20]研究表明以小米为主要原料的自然发酵酸粥的pH值为3.22～5.15。不同原料制作的酸粥pH值具有差异。不同地区酸粥细菌的组成具有相似性，但制作酸粥所使用的原料不同，这可能是造成不同地区酸粥pH值有差异的原因，需要进一步研究分析。

酸粥样品中脂肪含量为0.21～0.54 g/100g，蛋白含量为2.21～5.92 g/100g，水分含量为71.5～82.17 g/100g(表3)。薛建岗等[1]研究表明内蒙不同地区酸粥中脂肪含量为9.35～45.16 mg/100g，蛋白含量为0.33～0.89 g/100g，李文亚[11]研究表明晋西北地区酸粥脂肪含量为0.46 g/100g，蛋白含量为2.87 g/100g。以上实验结果说明，不同地区酸粥脂肪含量、蛋白含量不同，造成差异的原因可能是由于制作酸粥的原料不同。相关研究表明，糜米在经过发酵后脂肪含量和蛋白含量下降[11]，大米经蒸煮后蛋白含量下降[21]，但目前尚未有研究揭示蒸煮后的大米经微生物发酵后脂肪含量和蛋白质含量的变化规律，因此需要进一步实验说明发酵是否会降低大米的脂肪含量和蛋白含量。

表3 酸粥理化指标Table 3 Physical and chemical indexes of sour porridge

2.4.2 酸粥中8种维生素含量分析

酸粥中8中维生素平均含量为239.45 μg/mL，其中样品2的维生素含量最低，样品6的维生素含量最高(表3)。如图7所示，不同维生素在不同样品中具有差异。维生素B2、维生素B3、维生素B12的含量相对较高，维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9以及维生素C含量相对较低。其中维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12以及维生素C最高含量依次为46.01、127.79、4.83、2.94、11.30、5.25、278.30 和2.05 μg/mL。研究表明大米中不含维生素C[22]，维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12的含量分别为0.68、9.89、4.38、0.74、0.10、0.05和0.74 μg/g[23]。由此说明，以大米为原料的酸粥中维生素含量较高，营养价值高于大米营养价值，这些维生素可能是由微生物发酵所产生。

郭昊翔等[10]研究表明，内蒙地区酸粥中的维生素含量随发酵时间的增加而增加。其中维生素B3、维生素B12的最高含量分别为23.51、190.14 μg/mL，均低于本研究酸粥中维生素B3和维生素B12含量，其余维生素含量均高于本研究酸粥中维生素含量。

基于基因组信息统计结果得出，合成B族维生素相关微生物主要是变形菌门，其次为厚壁菌门、拟杆菌门、Parcubacteria和放线菌门[24]，本次实验中所检测到的优势细菌门中含有上述报道的细菌门。相关研究表明，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)能够合成维生素B6[25]，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)能够合成维生素B12[26]。本次实验中，发现酸粥中含有罗伊氏乳杆菌，其相对丰度占9.4%，未检测到植物乳杆菌，但在内蒙地区及晋西北地区酸粥中均分离出植物乳杆菌。这可能是广西酸粥中维生素B6含量低于内蒙地区酸粥维生素B6含量，维生素B12含量高于内蒙地区酸粥维生素B12含量的原因。

图7 酸粥中8种维生素含量Fig.7 Contents of 8 vitamins in sour porridge

2.4.3 酸粥中17种游离氨基酸含量分析

酸粥中17种游离氨基酸平均含量为54.53 mg/100mL，其中样品2的游离氨基酸含量最低，样品1的游离氨基酸含量最高。在样品2中未检测到半胱氨酸和组氨酸，在样品3中未检测到半胱氨酸，在样品5中未检测到精氨酸。

测定酸粥中17种游离氨基酸含量发现，酸粥中必须氨基酸赖氨酸含量为4.23 mg/100mL，苏氨酸为5.13 mg/100mL，蛋氨酸为2.38 mg/100mL(图8-a)，后两者的含量高于蒸煮后大米中的含量(苏氨酸0.8～0.83 mg/100g，蛋氨酸0.16～0.21 mg/100g[21])。由此说明酸粥的营养价值高于米饭。研究显示人体缺乏以上3种氨基酸会引起身体机能下降、引发疾病等[27]，因此认为酸粥是对人体有益的食品。酸粥中非必须氨基酸含量较高的为谷氨酸(11.51 mg/100mL)，丙氨酸(12.79 mg/100mL)，丝氨酸(5.06 mg/100mL)(图8-b)。

解春芝[28]、胡传旺[29]研究表明细菌的代谢作用是产生游离氨基酸的重要来源，并发现参与氨基酸代谢的微生物有乳酸乳球菌亚种(Lactococcuslactissubsp.)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等，王敏[30]研究表明葡萄球菌(staphylococcus)具有产酶能力，可将蛋白降解为氨基酸。本次实验检测到的乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、毕赤酵母属均为优势属，因此推断酸粥中氨基酸合成与这3类微生物有关。

图8 酸粥中17种游离氨基酸含量Fig.8 Contents of 17 free amino acids in sour porridge

2.4.4 酸粥细菌功能预测

通过对酸粥细菌菌群COG(clusters of orthologous groups)功能预测发现在酸粥细菌菌群中存在22个已知的功能相关基因簇和未知功能的基因簇(图9)。其中未知功能(S)基因簇丰度较高，除未知功能基因簇外，丰度较高的依次为翻译、核糖体结构与生物发生相关基因簇(J)、氨基酸转运和代谢(E)相关基因簇和碳水化合物运输和代谢(G)相关基因簇。

氨基酸转运和代谢(E)相关功能基因簇丰度较高，辅酶转运和代谢(H)相关基因簇丰度相对较低(图9)。对营养物质研究结果表明，发酵后酸粥中维生素及部分游离氨基酸含量增加。由此可以得出，在酸粥细菌菌群中存在与氨基酸转运和代谢、参与维生素代谢相关的基因簇。实验所测定的酸粥游离氨基酸含量高于维生素含量，相应的氨基酸代谢相关基因簇丰度高于辅酶代谢相关基因簇丰度。因此通过COG功能预测结合酸粥中维生素、游离氨基酸含量测定分析可以在一定程度上说明酸粥细菌菌群中存在参与相关代谢的细菌，为酸粥的深入研究提供理论支持。

图9 细菌COG功能预测箱线图Fig.9 COG functional box diagram for predicting bacterial gene function annotation

3 结论

广西扶绥酸粥中优势细菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)，优势真菌属为毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)和德克酵母属(Dekkera)。酸粥不同样品间脂肪含量、蛋白含量、pH、维生素以及游离氨基酸含量不同，其平均含量为脂肪0.37 g/100g，蛋白3.77 g/100g，pH 2.73。8种维生素总含量在样品中的平均含量为239.45 μg/mL，其中维生素B12的含量最高，维生素B3及维生素B2次之，其含量远高于大米中含量，并在发酵后产生维生素C。17种游离氨基酸的总含量在样品中的平均含量为54.53 mg/100mL，必需氨基酸赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸的含量高于蒸煮后大米中的含量，非必须氨基酸含量较高的为谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸。COG功能预测表明酸粥中存在参与氨基酸和辅酶转运和代谢相关的细菌，其中参与氨基酸转运和代谢的基因簇丰度较高，参与辅酶转运和代谢的基因簇丰度相对较低，说明酸粥中游离氨基酸和维生素含量增加与酸粥中细菌有关。

不同样品的微生物组成、理化指标和营养成分含量之间存在差异，可能是由于扶绥酸粥制作主要是以家庭为主，造成所采集的样品发酵程度不一从而产生差异。作为扶绥当地特色食品，酸粥营养成分丰富，是优良的保健食品，备受当地人民的喜爱。本研究为进一步开展广西扶绥酸粥研究奠定了基础。