血管内皮生长因子结合可降解壳聚糖治疗大鼠心肌梗塞的研究*

李延民 冯 艳 魏燕云 刘 静 王献忠 刘俊法 周 维

(邯郸市第一医院心内二科，邯郸 056000)

心肌梗塞(myocardial infaction，MI)的发生是因为冠状动脉突然受到了持续的缺血缺氧危害从而引起的心肌坏死[1]。大多数MI患者在临床上都表现出了胸骨后疼痛的症状，同时患者还表明了这种疼痛剧烈而持久[2]。除了疾病本身外，MI还能并发心律失常[3]、休克和心力衰竭[4]以及其他危急并发症，并危及到患者的生命[5]。目前，在临床上治疗MI的方法主要还是直接冠状动脉介入治疗法(PCI)[6]，但是这种治疗方法会在扩张阻塞血管的一瞬间引起心肌内活性氧的激增，对心肌造成二次伤害。血管内皮生长因子(VEGF)具有促进血管生成的作用[7-8]，有助于心肌的缺血区域建立新的侧支循环，增加缺血区供血，在MI的治疗中起到积极作用。根据曹雯等[9]介绍，可降解壳聚糖(DC)在37 ℃的环境中放置10～15 min就可以变为胶冻状，4～6周完全降解，VEGF可在此降解周期内完全转移至心肌细胞中发挥药效。另一方面，DC还具有一定的对抗氧化应激的作用，从另一个方面对缺血心肌进行保护。本研究将VEGF与DC结合作为研究对象，将其注射到MI大鼠的梗塞边缘区心肌内，观察MI大鼠的各项心功能指标，为可降解材料在治疗MI的领域内增加新的科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量280～320 g，购自河北省实验动物中心，实验动物生产许可证号为：SCXK(冀)2020-1-019。整个实验过程中对实验动物的操作均符合动物伦理学的标准，福利伦理审查编号：HDYYLLDW2020-K07。

1.2 试剂

戊巴比妥钠(Sigma)；0.9%氯化钠注射液；4%多聚甲醛(北京博奥拓达科技有限公司)；VEGF(Cytolab)；DC(Pronova Biopolymer A.S.)。

1.3 仪器

小动物呼吸机(瑞沃德生命科技有限公司，型号：R407)；多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂，型号：RM6240E)；PowerLab 4/35 四通道研究型高速记录仪及Millar导管(ADINSTRUMENTS，型号：PL3504，型号：spr-320)；小动物超声成像系统(Visual Sonics，型号：Vevo1100)。

1.4 动物分组

适应性饲养3 d后，32只SD大鼠被随机分为假手术组、模型组、VEGF组和VEGF+DC组,n=8。各组实验大鼠使用0.6%戊巴比妥钠进行麻醉，给药剂量为0.1 mL/100 g。麻醉后的大鼠连接呼吸机，开胸后对冠状动脉左前降支进行结扎以制造MI模型，其中假手术组只穿线不结扎。整个造模过程中大鼠需要监测心电图，实时记录，并以心电图的ST段抬高及左心室前壁心肌发白为造模成功的判定标准。造模后，对各组实验大鼠进行分组给药，假手术组和模型组在梗死边缘区心肌处注射100 μL生理盐水(0.9%)，VEGF组注射100 μL VEGF(2 μg/mL)溶液，VEGF+DC组注射100 μL 含VEGF(2 μg/mL)的DC溶液。给药后将胸腔缝合，观察大鼠待其恢复自主呼吸后将呼吸机撤除。

1.5 超声心功能检测

造模4周后大鼠进行超声心功能检测，按0.1 mL/100 g腹腔注射0.6%戊巴比妥钠。麻醉后的大鼠固定于恒温鼠板上，双下肢和右上肢涂抹导电胶，胸腹部进行脱毛，涂抹耦合剂进行检测，根据检测结果分别计算LVAW;s、LVAW;d、LIVID;s、LVID;d、LV Vol;s、LV Vol;d、EF%、FS%等指标。

1.6 血流动力学检测

对超声心功能检测完毕的实验动物直接进行血流动力学的检测，方法为经右颈总动脉将Millar导管插入到动物的左心室内来测定各组实验动物的左室舒张末压(EDP)、+dp/dt和-dp/dt三个指标。

1.7 左心室指数(LVM/BW)计算

各组实验动物的心功能检测完成后将心脏取出，小心剪去心包膜、胸腺及冠状动脉，生理盐水冲洗后在结扎线处横向中间切开分为上、下两个部分，将这两部分剪去右心室壁后一起称质量。下半部分保存于4%多聚甲醛用于HE染色。

1.8 HE染色

各组心肌均常规脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，HE染色。染色后的心肌切片通过显微镜观察各组病理性形态结构的变化。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 超声心功能检测结果

与假手术组相比，模型组大鼠LVID;s、LVID;d、LV Vol;s和LV Vol;d共4个指标均显著上升；LVAW;s、LVAW;d、EF及FS共4个指标均显著下降。这些指标的变化趋势共同反映了模型组大鼠因为MI而导致的心功能低下。同时，相较于模型组，VEGF和VEGF+DC组大鼠的各项心功能指标均有不同程度的改善。详见图1、图2及表1。

图1 超声心功能检测Fig.1 Ultrasonic cardiac function test

图2 心功能指标变化柱状图注：与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001Fig.2 Histogram of changes in cardiac functionNote:Compared with the sham operation group,###P<0.001；Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表1 心功能指标变化Table 1 Changes in cardiac function

2.2 血流动力学检测结果

模型组大鼠的EDP值与假手术组相比呈现显著的上升趋势；同时+dp/dt和-dp/dt值呈显著下降趋势。VEGF组和VEGF+DC组与模型组相比，各指标均显示不同程度的改善并且VEGF+DC组的改善效果要优于VEGF组。详见图3及表2。

图3 血流动力学变化注：与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001Fig.3 Hemodynamic changesNote: Compared with the sham operation group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表2 血流动力学变化Table 2 Hemodynamic changes

2.3 LVM/BW计算结果

如图4及表3所示，模型组大鼠LVM/BW显著高于假手术组，经过VEGF及VEGF+DC的4周治疗，MI大鼠的左心室指数显著降低，且VEGF+DC组降低更为显著。

图4 左心室指数变化注：与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001Fig.4 Left ventricular index changesNote：Compared with the sham operation group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表3 LVM/BW变化Table 3 Left ventricular index changes

2.4 HE染色病理结果

如图5所示，假手术组心肌细胞排列整齐，未出现空泡化，无核固缩现象；模型组心肌细胞分布散乱无章，出现细胞空泡化现象且有明显的核固缩，说明心肌发生严重坏死现象；VEGF组对比模型组心肌细胞排列较为整齐，有核固缩减轻，无细胞空泡化；VEGF+DC组有大量心肌细胞呈整齐排列，治疗效果好于VEGF组。

图5 HE染色(×200)Fig.5 HE Staining(×200)

3 讨论

随着人口老龄化，心血管疾病已经严重威胁人类的健康，其中心力衰竭以及MI是造成较高病死率的主要原因。MI后的心室壁会变薄，发生的各种炎症反应会导致心肌形成瘢痕组织，进而发展为左室壁重塑，最终形成心力衰竭，这是一种严重且不可逆的变化。因此，MI后迅速而有效地建立侧支循环对改善梗死区血液供应和梗死区心肌的存活有着积极的意义[10]。

VEGF是由Senger[11]在肿瘤细胞培养液中发现的，因其能増加毛细血管通透性而被命名为血管通透性因子(vascular permeability factor，VPF)。随后在1989年，另一个研究组在牛垂体滤泡状细胞的培养基中发现一种具有诱导血管生成作用的分泌型生长因子，并将其cDNA测序，测出的cDNA序列与Senger研究组发现的VPF的cDNA序列相同，编码的蛋白完全相同，此后统一称为VEGF[12]。VEGF与其他多种生长因子同样都具有促进血管新生的功能，而VEGF是目前公认的特异性最强且活性最强的直接促进血管新生的生长因子[13]。因为VEGF不仅能促进在现有血管的基础上形成新的血管，还能促进血管从的新生以及动脉的生成[14]。其机制在于VEGF刺激内皮细胞，使其分裂增生形成突起的幼芽，这种作用会随着内皮细胞一起向前移动从而形成一条细胞索；细胞索继续分裂增生形成管腔，也就是新生的毛细血管，各毛细血管彼此吻合就构成了新的毛细血管网。

近年来，有研究者发现了一种新型的可降解的材料，他们将甲壳类动物的外壳经过脱酰基化处理后形成了线性结构的糖类，因此将这种材料称为壳聚糖。2009年，Lu等[15]为研究壳聚糖将其与胚胎干细胞混合，并将混合溶液通过注射的方式对MI的边缘区心肌进行给药，治疗4 周后对实验动物进行超声心功能检测，检测结果显示该组实验动物的LVID;s、LVID;d、左室射血分数(EF%)及短轴缩短率(FS%)均得到了不同程度改善，同时MI面积和室壁的厚度相较于对照组也呈现下降趋势。除各心功能指标的提升外，该组大鼠在移植区内还检测到了大量的新生血管，这些新生的血管为细胞提供了丰富的营养，使得细胞得以存活。在此药效学实验结果的基础之上Liu等[16]对壳聚糖的机制进行了研究。众所周知，MI发生的瞬间心肌会产生大量的活性氧，这种活性氧会导致受损心肌受到二次伤害，对移植入的干细胞也有一定损害。Liu等[16]的研究结果表明活性氧可以被壳聚糖有效的清除，使得细胞生存的环境得以改善，帮助了细胞在恶劣环境中得以存活。因为壳聚糖发现的时间并不长，所以目前对它的研究并没有很多，但是根据现有的研究我们可以知道，将壳聚糖作为一种新型材料应用在医学领域具有不良反应少，且应用范围广的优点，所以在未来壳聚糖会有很好的发展前景。

本研究结果表明VEGF对大鼠的MI具有一定的改善作用，当VEGF与DC结合后，MI大鼠的心功能较单用VEGF组相比更为显著，这说明了DC可以加强VEGF对MI的改善作用。因此，DC在MI治疗中发挥辅助作用，这为以后MI的治疗打开了新的视角。