MAOA在诱导前列腺癌神经内分泌分化中的作用*

税 雪 许 荣 谢清华 张彩勤 谭邓旭 师长宏 赵菊梅

(1. 延安大学医学院，延安 716000)(2. 空军军医大学实验动物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一种雄激素驱动的疾病，它依赖于配体介导的雄激素受体(androgen receptor，AR)激活从而促进疾病进展[1]。尽管雄激素剥夺可以有效控制肿瘤生长，但大多数患者最终会发展成为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[2]。Watson等[3]、Parker等[4]以及Hussain等[5]研究表明，大多数CRPC仍依赖于AR信号通路，一些新型的AR通路抑制剂(androgen receptor inhibitor，ARPI),如：恩杂鲁胺(enzalutamide，ENZ)和阿比特龙作为治疗药物应用于晚期前列腺癌患者以延长生存期。Nadal等[6]和Bishop等[7]报道，ARPI会诱导神经内分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer，NEPC)，出现特征性多器官转移，导致难以治愈。目前，ARPI引起PCa神经内分泌分化(neuroendocrine transdifferentiation，NED)的确切分子机制尚未完全阐明，主要原因是缺乏模拟临床特征的异质性转化模型。因此，构建NEPC转化模型已成为PCa防治研究亟待解决的重大问题。

单胺氧化酶A(monoamine oxidase A，MAOA)是一种位于线粒体上的氧化还原酶，通过氧化脱氨催化膳食胺和单胺神经递质降解，产生副产物过氧化氢，即活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要来源[8-10]。Trachootham等[11]报道，ROS可使细胞发生氧化损伤，进而导致肿瘤的发生和发展。Wu等[12]、Liao等[13]及Li等[14]研究证实MAOA表达水平的升高会促进PCa细胞发生上皮—间质转化，诱导癌细胞干性等。目前，MAOA对ENZ诱导NED的影响还未见报道。因此，本研究拟通过ENZ诱导建立NEPC细胞模型和动物模型，探索MAOA在该诱导过程中发挥的作用及潜在机制，旨在为揭示 NEPC的发生机制提供良好的模型，为PCa的治疗提供新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：本研究选用15只6～7周龄SPF级雄性BALB/c裸鼠，体质量22～25 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010，在空军军医大学实验动物中心SPF环境中饲养和繁殖，实验动物使用许可证号：SYXK(陕)2018-001。动物实验通过空军军医大学实验动物福利及伦理委员会批准，动物伦理证书编号：20190207。

1.1.2细胞：人前列腺癌细胞C4-2和22RV1购自国家实验细胞资源共享平台。细胞培养条件为RPMI-1640培养基(10%胎牛血清+1%青链霉素)，37 ℃、5% CO2孵箱中培养。

1.1.3试剂：RPMI-1640培养基和0.05%胰酶购自HyClone；FBS购自浙江天杭生物科技股份有限公司；免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot制胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；MAO-Glo试剂盒购自Promega;荧光定量PCR等分子生物相关试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。抗体：神经内分泌标志物抗体(CGA和SYP)和前列腺癌特异性抗体(PSA和AR)均购自Abcam；神经内分泌标志物抗体ENO2抗体购自ProMab；Actin抗体和二抗购自康为世纪生物科技股份有限公司。药品：ENZ购自Selleck；MAOA特异性抑制剂氯吉灵(clorgyline,CLG)购自MCE；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.1.4仪器：酶标仪购自Biotek Take；基因扩增仪购自Eppendorf；Real-time PCR购自StepOne Plus、Thermo Fisher等。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和Real-time PCR：使用TRIzol破碎和溶解细胞， 收集总RNA。使用逆转录酶逆转录获得cDNA。使用 Step One Plus 实时 PCR 检测系统(Thermo Fisher ABI)，PrimeScriptTMRT 试剂盒和 TB Green® Fast qPCR Mix(Takara)进行Real-time PCR实验，95 ℃聚合酶激活3 min，然后进行40个循环的两步法PCR(95 ℃、30 s和60 ℃、40 s)，最终PCR反应结束后直接进行熔解曲线分析。使用2-ΔΔCT方法计算mRNA的相对表达水平，β-actin作为内参。

1.2.2免疫印迹分析：细胞或破碎后瘤体组织，使用RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集上清液，使用BCA法进行蛋白定量。蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到PVDF膜上并在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h。特异性一抗4 ℃孵育过夜，酶标二抗室温2 h后，通过ECL试剂盒观察细胞膜上的信号。β-actin作为内参。

1.2.3MAOA活性分析：荧光素酶裂解缓冲液裂解1×104个细胞，MAO-Glo试剂盒分析细胞裂解液的MAOA活性，MAO-Glo检测系统记录荧光信号值[15]。

1.2.4MTT法检测各细胞株耐药指数：将2×103/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，使用100 μL含有不同浓度的ENZ培养基培养细胞96 h后，向每孔加入培养基/ CCK8混合物(9∶1)，继续孵育2.5 h，用酶标仪检测，于450 nm处读取吸光度值。

1.2.5体内实验：所有小鼠均接受手术去势，于一周后右侧皮下植入1 × 106个22RV1细胞，建立异种移植模型。肿瘤体积=1/2 ×(长轴 × 宽轴)2。当肿瘤体积达到100 mm3，将小鼠随机分为三个治疗组，A组：对照组(22RV1)、B组：10 mg/kg的ENZ每日灌胃(22RV1+ENZ)及C组：10 mg/kg ENZ+10 mg/kg 的CLG，每日腹腔注射(22RV1+ENZ+CLG)，n=15。治疗两周后视为实验终点，对所有荷瘤小鼠CO2窒息处死，并取组织用于免疫组化分析。

1.2.6免疫组化：小鼠肿瘤组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm切片，通过间接免疫过氧化物酶技术进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察出现背景清晰的棕色或棕黄色颗粒判为阳性染色。

2 结果

2.1 ENZ诱导的NEPC模型建立与表征

为了选择适合NED研究的PCa细胞系，对PCa细胞系C4-2和22RV1对AR抑制剂的敏感性进行了评估。MTT检测结果显示，C4-2细胞对ENZ敏感，22RV1细胞对ENZ不敏感(图1A)，因此选择C4-2细胞进行 10～20 μmol/L ENZ连续诱导培养4个月，以期获得神经内分泌样的细胞。结果如图1B所示，与亲本相比，ENZ处理的C4-2细胞能在更高浓度的药物中增殖，耐受浓度从34.64 μmol/L升高至82.17 μmol/L。同时，细胞形态发生明显改变，呈现突触增多、胞体聚集等神经样细胞表型(图1C)。因此，将ENZ耐药细胞株C4-2命名为C4-2ENZR。Western blot结果表明，与亲本细胞相比，C4-2ENZR细胞中NE标志物嗜铬粒蛋白A(CGA)、突触素(SYP)和神经元特异性烯醇化酶(ENO2)的蛋白表达增加，腺癌标志物雄激素受体(AR)表达降低(图1D)。这表明该细胞模型为NEPC模型[7]。

图1 NEPC模型的建立注：***P<0.001Fig.1 Establishment of NEPC modelNote：***P<0.001

2.2 NEPC细胞模型中MAOA表达升高

根据Wu等[12]报道，MAOA的表达与PCa的恶性程度相关,因此使用Oncomine数据库分析MAOA在两个不同临床队列的表达。结果显示，与正常前列腺组织相比，人类PCa组织中MAOA的表达更高，且与Gleason评分呈正相关(图2A)。进一步通过RT-PCR和Western blot检测发现，与亲本C4-2细胞相比，C4-2ENZR细胞中MAOA的mRNA和蛋白的表达显著升高(图2B、图2C)，从而验证了上述生物信息学结果，即：MAOA可能在ENZ诱导的NED中起关键作用。

图2 MAOA的表达与ENZ诱导的神经内分泌分化有关注：*P<0.05，**P<0.01Fig.2 The expression of MAOA is associated with the development of NED induced by ENZNote：*P<0.05, **P<0.01

2.3 MAOA抑制剂CLG可以延缓ENZ引起的NED发生

CLG作为一种选择性抑制剂，可以显著降低MAOA酶的活性(图3A)。对C4-2细胞进行ENZ给药时，同时添加1 μmol/L的CLG联合处理细胞2个月后检测发现，ENZ与CLG联合使用可以减轻ENZ所引起的神经内分泌样细胞形态学改变，并抑制神经内分泌标志物NCAM1和ENO2表达(图3B、图3C)。这表明MAOA是促进NED和维持神经内分泌细胞特性的关键因素，以MAOA为靶点的抑制剂CLG可以延缓ENZ引起的NED的发生。为了进一步证实体外细胞系研究的结果，建立了22RV1裸鼠异种移植模型，结果显示ENZ确实可以诱导NEPC体内模型形成，该模型表现出超高水平的神经内分泌标志物阳性表达。更重要的是，与ENZ单药治疗的肿瘤相比，ENZ+CLG联合使用能够降低22RV1小鼠肿瘤中的神经内分泌标志物表达(图3D)。

图3 MAOA抑制剂CLG可以显著延缓体内和体外的NED注：***P<0.001Fig.3 Clorgyline, inhibitors of MAOA, can significantly delay NED in vivo and in vitroNote：***P<0.001

2.4 靶向MAOA抑制缺氧信号以克服NED

缺氧是多种实体瘤的常见情况，Lu等[16]研究发现，缺氧可以促进ROS的产生，从而促进疾病进展。Shih等[10]证实，MAOA介导的酶促反应产生大量作为ROS主要来源的过氧化氢。因此，流式分析C4-2、C4-2+ENZ 和C4-2+ENZ+CLG细胞的ROS水平。如图4所示，MAOA刺激ROS的产生，由26.5%增至48.8%；CLG延缓ROS的升高，使其降为40.3%。以上结果提示，MAOA可以通过改变C4-2细胞中的缺氧信号来克服ENZ引起的NED。

图4 MAOA 激活缺氧信号以促进 NEDFig.4 MAOA triggers hypoxia signaling to promote the NED

3 讨论

PCa是老年男性患者死亡的主要原因之一，NEPC属于PCa的终末阶段，侵袭性强且预后极差[17]。目前NEPC的研究进展缓慢，主要是缺乏模拟临床特征的异质性转化模型[18]。因此， NEPC模型的构建是本研究的关键。通过ENZ构建具有神经内分泌特征的NEPC体外模型C4-2ENZR，该细胞模型高表达SYP，CGA和ENO2，低表达AR，为典型的NEPC细胞。体内模型选取22RV1细胞系，相比于C4-2细胞，22RV1细胞在裸鼠体内具有较好的成瘤率，并且对ENZ表现出耐药性，更接近于NEPC特征[7,19]。本研究将22RV1移植入去势小鼠体内建立异种移植模型，进一步用ENZ诱导并经组化染色证实，神经内分泌标志物SYP表达强阳性，提示该模型具有NEPC特征。以上模型的成功建立为后续分子机制研究提供了坚实基础。

目前，ENZ引起NED的具体机制仍不完全清楚。Luo等[20]发现LncRNA-p21调节EZH2/STAT3信号通路改变ENZ诱导的PCa NED。Bishop等[7]也发现主神经转录因子(BRN2)是AR抑制后NEPC形成的主要驱动基因，但MAOA与NEPC的关系尚未见报道。此外，目前除化疗外，尚无针对NEPC患者的有效治疗方法。一些靶向抑制剂，如EZH2抑制剂GSK126[21]，AR降解增强剂ASC-J934[21-23]等被证明能起到一定的治疗效果，但多处于临床前研究或临床试验阶段，距离新药上市时间较长。因此，重新利用现有药物是解决这些问题的有效方法。

现有的抗抑郁药物CLG可有效抑制MAOA的活性，Wu等[15]发现CLG可以扰乱导致癌细胞侵袭和增殖的信号通路，进而抑制PCa进展。同样，本研究也证实，在晚期PCa中，靶向MAOA可能是抑制PCa进展的潜在治疗策略，结果表明(1)ENZ处理后，MAOA的活性和表达量增加，提示MAOA可能在ENZ诱导的NED中起关键作用；(2)MAOA升高可以促进神经神经内分泌标志物的表达，并且可能通过改变下游缺氧信号通路实现的。最重要的是，证明CLG可以有效延缓ENZ引起的NED。

综上所述，本研究证实，MAOA是促进NED和维持神经内分泌细胞特性的关键因素，现有的MAOA抑制剂CLG可以延缓NEPC发生。将CLG与ENZ联合使用，有可能成为PCa患者的新型治疗方案。