阿尔茨海默症基因修饰小鼠模型*

李志萍 杨利峰 周向梅 赵德明

(中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室，北京 100193)

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是常见的中枢神经系统退行性疾病，典型病理特征为脑组织内大量淀粉样蛋白沉积，临床表现为记忆力衰退、认知功能障碍和行为异常改变[1]。在AD动物模型的研究中，基因修饰小鼠模型通过改变基因组的表达，将基因型和表型关联，实现对疾病发生发展过程的机制研究。现已发现多种基因与AD相关，如淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)基因、Tau蛋白基因、载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因、早老蛋白(Presenilin，PS)基因、ob(leptin)基因等。围绕这些基因在指定位点上进行突变，开发出不同的基因修饰小鼠模型来模拟AD的发病过程或者是对药物治疗效果的评价，对深入了解疾病的发生发展提供重要的科学工具。本研究总结了APP、PS-1、APOE及ob这4种基因与AD疾病的相关性，并探讨隐藏突变人类基因小鼠的病理特征、表型差异以及在科学研究中的应用。

1 APP基因修饰小鼠模型

神经纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)是AD患者的两大病理特征，SP的形成原因是第21号染色体上的APP基因突变造成的[2]。APP基因突变及异常表达，可以部分解释多肽的降解路径及AD的发病机制。目前，APP转基因小鼠仍不能复制出AD患者中枢神经系统中广泛的神经元死亡现象[3]。

PDAPP小鼠：首次报道能产生AD病理样病变的转基因小鼠，由C57BL/6鼠与DBA/2鼠交配产生[4]。PDAPP小鼠能过表达APP的三种形式(695、751和770)，6～9个月形成淀粉样斑块，并表现出与年龄相关的空间学习障碍[5]。PDAPP小鼠模型的建立进一步支持了APP和β淀粉样蛋白(Aβ)在AD发病中的作用，有利于研究Aβ产生和沉积的抑制机制和治疗途径。

Tg2576小鼠及APP23小鼠：由两种转基因品系在不同启动子的驱动下和不同的APP亚型表达相同的突变产生。Tg2576小鼠是转APP695基因小鼠，APP23小鼠是转APP751基因小鼠，APP23小鼠比Tg2576小鼠的更具有致病性[5-6]。APP23小鼠在6月龄开始形成淀粉样蛋白，而Tg2576小鼠在11月龄才开始形成淀粉样蛋白。APP23在3月龄开始出现记忆障碍，而Tg2576小鼠记忆障碍发生在10月龄[5-6]。APP23在海马CA1区显示神经元丢失而Tg2576不显示。除此之外，两种小鼠都有脑淀粉样血管病(cerebrai amyloid angiepathy，CAA)的发展，Tg2576在血管周围发现95%的致密斑块，APP23出现自发性出血性中风，临床上约有90%的AD患者可能发展为CAA，这两种品系的小鼠同时还可提供CAA模型研究血管病[7]。

TgCRND8小鼠、J20小鼠和TASD小鼠：它们是APP双突变小鼠，TASD结合Swedish和London双突变，TgCRND8和J20是结合Swedish和Indiana突变[8]。双突变模型与单突变模型相比，Aβ聚集与沉积更为快速，形成SP的年龄显著降低，此类小鼠更有利于早发性AD的研究。TgCRND8小鼠两个突变位点的结合导致非常高水平的Aβ42产生，3月龄表现为显著的认知功能障碍，并可见典型的SP、神经元丢失及行为学上多种能力的损伤[9]。J20小鼠海马和皮质区表现年龄依赖性的SP，6～7月龄出现学习和记忆缺陷，显示脑部癫痫与海马区代偿性抑制相关，提示类似癫痫类异常兴奋的神经元活动可能代表了促进认知障碍产生的上游事件[10]。

2 PS-1和PS-2基因修饰小鼠模型

PS-1位于14号染色体，PS-2位于1号染色体，PS-1和PS-2是γ-分泌酶的组成部分，γ-分泌酶裂解APP产生蛋白片段Aβ40和Aβ42，较长片段的Aβ42可能导致淀粉样斑块的形成和AD的发展[11]。包含PS突变的小鼠模型会使Aβ42/Aβ40的比例增加，但不形成淀粉样斑块，因此将APP和PS转基因小鼠杂交形成双转基因系，双基因小鼠比单基因系更早显示出淀粉样蛋白的积累和认知障碍。

PSAPP小鼠：M146L PS由C57BL/6与DBA/2F小鼠杂交产生，PSAPP小鼠比原始的单基因Tg2576小鼠更早的发生Aβ斑块沉积，并且能增加Aβ42的产量[12]。PSAPP小鼠甚至在斑块沉积前出现Y迷宫缺陷，这一发现更加清楚地解释了斑块沉积与认知缺陷之间的关系。

2xKI小鼠：其APP基因被设计为表达Swedish突变加人源Aβ序列，PS基因被设计为表达与FAD相关的P264L[13]。无论APP突变还是PS突变都不能单独导致淀粉样蛋白病变，但2xKI小鼠可以。2xKI小鼠在标准版本的Morris水迷宫中没有缺陷，但在更具挑战性的任务中存在缺陷。在这个任务中，一旦它们知道了平台的位置，平台就会被移动，从而要求小鼠学习其新位置[14]。2xKI小鼠模型的优点之一是Aβ的沉积随时间呈线性增加，而其它基因突变小鼠的Aβ沉积呈指数增长[14]。

5xFAD小鼠：结合5个与AD相关的突变，包括APP中的Swedish、Florida(I716V)及London(V717I)突变和PS-1中的M146V，L286V突变是一个发展更为快速的品系[15]。5xFAD小鼠在1.5月龄即可表达细胞内的Aβ，2月龄时出现胞外Aβ沉积及形成SP，4～6月龄出现淀粉样病理变化和认知障碍[16]。此外，与其他APP突变或APP+PS-1突变小鼠不同，5xFAD小鼠9月龄时大脑皮质出现大量神经元丢失，与淀粉样蛋白沉积出现的区域相同，因此成为研究AD病变机制的一个有利模型[17]。Oakley等[17]在较早月龄的5xFAD转基因小鼠中观察到AD大脑皮质、海马等区域形成大量淀粉样斑块沉积，NFT形成等多种神经病理损害，并同时表现出明显的行为学异常。

3xTg-AD小鼠：结合APPSwe、PS1M146 V和TauP301 L突变的三重转基因小鼠[18]，是首个在AD病变的相关区域形成淀粉样病变和NFT的动物模型，因此被广泛用于AD的研究。该模型有利于帮助阐明Aβ、NFT及突触功能紊乱三者之间的关系，同时适用于研究针对Aβ及NFT两种病理变化的AD疗法[18]。3～4月龄小鼠皮质区出现胞内Aβ免疫反应，4月龄水迷宫实验中表现长期记忆功能障碍，6月龄在海马CA1锥体神经元出现胞内Aβ免疫反应，皮质出现Aβ胞外沉积，并表现短期记忆功能受损，12月龄出现Tau蛋白的构象变化，15月龄皮质区有严重的Aβ沉积，Tau蛋白高度磷酸化，18月龄神经突周围观察到明显的球状结构。3xTg-AD小鼠能同时表现SP和NFT，神经元死亡和突触丢失等病理特征，更接近于临床疾病的研究[19]。除淀粉样病理学之外，3xTg-AD小鼠还是研究最多的Tau蛋白病模型[20]。

3 Apo E基因修饰小鼠模型

ApoE基因有三种亚型，其中ApoE4是阿尔茨海默症的主要遗传学风险因子，携带这一基因的人患AD的风险比其他人高15倍[21]。ApoE4能使Tau蛋白磷酸化增加，干扰微管的装配和完整性，导致NFT[22]。将ApoE序列定位引入小鼠基因组，同时呈现癫痫表型，病程变化与AD患者更为类似，是转基因未来发展的一个趋势。由于该模型所诱导的具体AD病理改变的机制还不十分清楚，仍有待进一步研究。

Dumanis等[23]用现有的AD转基因小鼠与携带人类ApoE4基因的小鼠杂交，得到新型小鼠模型，对该模型的研究显示，携带ApoE4转基因的小鼠与携带其他ApoE突变的小鼠相比，大脑中低聚形式的β淀粉样蛋白更多，说明ApoE4的作用机制可能会影响Aβ的累积。这一新型模型是首个能体现ApoE4与β淀粉样蛋白之间作用的模型。另外，还可对携带人类ApoE转基因的小鼠进行药物测试，以获得更加全面的治疗效果。

4 Ob基因修饰小鼠模型

Ob基因位于7号染色体，编码瘦素(Leptin)。Leptin能下调BACE的表达，增加ApoE介导的Aβ的清除。下丘脑中Leptin功能缺乏会增加2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)及肥胖的风险，这些都是AD的危险因素[24]。

ob/ob小鼠：是ob基因纯合突变的小鼠，特征是肥胖及多食，最终发展为T2DM。ob/ob小鼠显示出海马区长期无效的增强作用和焦虑行为，神经元树突棘密度减少，促进Aβ的累积，大脑皮层中Tau蛋白裂解和过度磷酸化增加[24]。Sebastião等[25]证实，ob/ob小鼠与APP23模型杂交的后代表现出与AD相同的认知功能障碍，却没有淀粉样蛋白增加，表现出脑血管炎症和严重的CAA。目前，ob作为一种新的疗法，可能为AD研究进展带来新的发现。不过与AD的其他基因修饰模型相比，ob/ob小鼠模型的疾病机制更为复杂。另一个可进行比较的模型是db/db小鼠。除了有相似的肥胖及多食之外还表现出高血糖，db/db小鼠伴随有神经纤维缺失、运动神经传导受损等周围神经病变。刘滢[24]在对该模型的研究中还发现该小鼠在水迷宫中存在空间学习和记忆缺陷[24]。这可能会对AD研究提供有利的帮助。

5 基因修饰小鼠模型的发展与前景

在AD研究中最重要的基因修饰小鼠关键特征，见表1所列。

表1 AD基因修饰小鼠模型的关键特征[26]Table 1 The key features of the gene modified mouse models of AD[26]

理想的AD模型除了能在遗传学上模拟AD特征性病理学改变之外，还需模拟人类AD患者的行为学改变。当前AD的发病机制还不十分明确，现有的动物模型是依据不同的机制假说而开发，并且由于基因表达可以被宿主的遗传背景所修饰，不管是单转基因模型还是多转基因模型大多只是片面复制AD的特征性改变，难以全面模拟AD的病理改变。此外，由于各物种之间存在许多差异，因此必须在不同的物种上测试同一药物，以评估有效性和安全性。

虽然当前的基因修饰小鼠模型还存在一些不足，但对阐明AD具体致病机制依然具有重要的价值，在药物开发临床前研究中起着关键作用以及对致病机制的新见解做出了贡献。随着与AD相关新基因的发现，基因构建将更加完善，基因修饰模型也更加接近人类AD的全部特征，伴随良好模型的不断开发将显著加速对AD发病机制的研究和治疗药物筛选的进程。