GC-MS测定西洋参中的腐霉利

朱日然，牛水蛟，刘 莹，张先勤，李启艳，林钰镓＊

（1. 山东中医药大学附属医院，山东 济南250012；2. 山东省食品药品检验研究院/国家药品监督管理局 化妆品原料质量控制重点实验室，山东 济南 250101；3. 济南市历下区卫生和计划生育监督所，山东 济南 250021）

西洋参，五加科人参属植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的干燥根[1]，最初生长于北美洲原始森林中，主产于加拿大和美国，后经引进，在我国辽宁、山东、吉林、北京等地广泛种植[2]。西洋参性凉、味甘、微苦，补气养阴性能极佳，在治疗阴虚津伤、气阴两虚等方面较人参更为柔和，适宜于中老年及身体虚弱人群食用[3]。现代医学研究发现，西洋参作为临床贵重药材之一，在提高免疫力、抗癌、降血糖等方面有显著功效[4]。但作为一种外来名贵药材，西洋参同样面临多种病害的威胁，如西洋参1～2年生上立枯病、拌倒病的发病率较大，在3～4年生上黑斑病、白粉病的发病率较大[5]。庄绪静等[6]采用腐霉利对西洋参病害进行防治，得到了较好的效果。

腐霉利（速克灵、二甲菌核利），国际通用名：Procymidone，化学名称：N-（3,5-二氯苯胺）-1,2-二甲基环丙烷-1,2-二羰基亚胺，结构见图1，是一类环酰亚胺类农用内吸性杀菌剂，于1972年由日本住友化学株式会社研制成功。主要通过抑制菌体内甘油三酯合成，达到保护和治疗农作物病害的双重作用[7]。

图1 腐霉利结构式

然而作为一种有机氯农药，腐霉利对人体和土壤环境均有一定危害，因此，欧盟和美国等国家或地区，相继对进口食品中的腐霉利残留量提出了严格的限量标准，如欧盟规定果蔬中腐霉利的最大残留限量（maximum residue limit，MRL）值为0.02 mg/kg，美国食品和药物管理局（FDA）和加拿大规定葡萄酒中腐霉利的MRL值分别为0.2 mg/kg和1.0 mg/kg，日本实行的“肯定列表制度”中有关食品限量的暂定标准规定腐霉利的MRL值为0.02 mg/kg，而对于其他在暂定标准以外的农业品实行“一律标准”，即0.01 mg/kg[8]，我国也制定了蔬菜和油脂等产品中腐霉利残留的限量标准[9]。

目前腐霉利残留的检测方法主要有气相色谱法[10]、荧光光谱法[11]、高效液相色谱法[12]、气相色谱-串联质谱法[13]等。前处理方法主要有固相萃取法[14]、基质固相分散萃取[15]、QuEChERS法[16]等。QuEChERS法是一种较新颖的前处理方法，具有分析速度快，溶剂使用量少，简便、快速、灵敏、准确等优势，可简化繁杂的净化步骤。气相色谱-串联质谱法（GC-MS）具有定性、定量准确，灵敏度高，线性范围广等优点。本研究采用乙腈提取，QuEChERS净化，外标法定量，GC-MS法测定西洋参中腐霉利的残留量，以期建立一种快速检测西洋参中腐霉利残留量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo TRACE 1300-ISQ气相色谱质谱联用仪（赛默飞公司）；Mettler Toledo MS 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（Millipore有限公司）； Universal320R高速冷冻离心机（德国Hettich公司）；KQ-500DE 型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

QuEChERS萃取盐包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g柠檬酸钠+0.5 g柠檬酸氢二钠）；QuEChERS净化管15 ml（400 mg PSA+400 mg C18+1200 mg MgSO4）。

腐霉利对照品，纯度99.8 %，批号B0003652，Be Pure公司；甲苯、乙酸乙酯、乙腈等有机溶剂均为分析纯；QuEChERS快速净化小柱。

1.2 仪器条件

色谱柱：DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气：氦气，纯度≥ 99.999 %；恒流流速：1.00 ml/min；进样方式：不分流；离子源：EI源，离子源温度：230 ℃；电离能量：70 eV；色质接口温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；进样量：1 μl，溶剂延迟：8 min。

升温程序：100 ℃保持1 min，以15 ℃/min速率升温至280 ℃，然后保持15 min，运行总时间28 min。

测定方式：全扫描和选择离子监测同时采集模式。全扫描离子（m/z）：50-300；监测离子（m/z）：96，254，283，285；定量离子：m/z 285。

1.3 样品溶液的制备

称取西洋参粉末（过三号筛）2.0 g置入50 ml具塞离心管中，先加入水10 ml涡旋混匀，再加入乙腈10 ml和QuEChERS萃取盐包，用力振摇1 min，4000 r/min离心5 min。先用2 ml甲苯预饱和净化管，混匀净化管，取6 ml乙腈层加入净化管中，涡旋混匀后4000 r/min离心3 min，然后取上清4 ml 40 ℃氮气吹干，加丙酮1 ml复溶后，过0.22 μm有机滤膜，滤液待测定。

1.4 标准溶液的制备

吸取一定量腐霉利对照品（in acetone）置入10 ml量瓶，用丙酮逐级稀释并定容得到0.5，1.0，2.5，5.0，10 μg/ml的腐霉利系列标准工作溶液，上机测定。

1.5 色谱及质谱行为

在上述仪器条件下，分别对标准溶液和样品进行测定，得其保留时间为14.59 min，丰度比m/z 96: 254: 283: 285 = 100: 3: 37: 23，见图2、图3。

图2 标准溶液的总离子流图及选择离子流图

图3 样品溶液的总离子流图及选择离子流图

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 线性范围、检出限和定量限 测定“1.4”项中的标准溶液，以面积对浓度作图，浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。同时，将标准溶液进行稀释并测定，以S/N=3时的浓度计算检出限，以S/N=10时的浓度计算定量限，结果见表1。

表1 腐霉利保留时间、线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.1.2 回收率 按“1.2”项方法对空白样品进行低、中、高3个水平的加标回收试验，每水平各测定6份，分别计算回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2 回收率试验结果（n=6）

2.1.3 稳定性 取浓度为5 μg/ml标准溶液对腐霉利进行稳定性测试，按上述仪器条件分别在0，2，4，8，12，24 h进行测定，根据测定的目标化合物峰面积计算RSD为1.99 %，表明该成分在24 h内稳定。

2.1.4 日内和日间精密度 取浓度为5 μg/ml标准溶液对腐霉利进行精密度研究，于一日内连续进样6次，计算峰面积日内精密度RSD为0.86 %；连续进样3天，每天6次，计算3天的峰面积日间精密度RSD为1.66 %，表明日内及日间精密度结果均良好。

2.1.5 重复性 取一批样品，精密称定6份，按“1.3”项法制备，按上述仪器条件分别进行测定，根据测定的目标化合物浓度计算RSD，结果为2.09 %，表明该方法重复性良好。

2.2 样品测定

本研究共收集不同产地的西洋参药材35批，采用上述方法对该35批样品进行前处理并测定，每批样品平行测定2份，结果表明，共有10批药材检出腐霉利，浓度为1.06～3.73 mg/kg。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

QuEChERS法有多种提取溶剂，常用的有乙腈、乙酸乙酯、丙酮等，三者对有机化合物提取效果略有不同。本实验选用乙腈作为提取溶剂，主要有以下3个原因：（1）丙酮与水的互溶度较大，可能导致待测组分的回收率降低；（2） 提取弱极性的化合物时可选用乙酸乙酯，而对于较强极性的成分，乙酸乙酯提取效果不佳；（3）腐霉利结构中含有2个内酰胺键，极性较大，适合用乙腈提取，且乙腈对脂肪和色素的溶解性相较丙酮和乙酸乙酯最低，故选择乙腈作为提取溶剂。

3.2 前处理方法的选择

QuEChERS法是一种新颖的样品前处理技术，最初主要用于蔬菜水果样品中的农药残留分析，随着研究的深入，QuEChERS法已扩展应用到诸多领域。相对于传统的前处理方法，QuEChERS法是向提取液中加入硫酸镁等干燥剂和碳18等杂质吸附剂，简化了样品的前处理步骤，提高了前处理工作效率，降低了实验中各因素误差。

常用盐析试剂组合是醋酸钠和柠檬酸钠两种体系，本研究选择了含有4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠的缓冲盐体系，其中无水硫酸镁用于除去基质中的水分，其余的缓冲盐用于提供适宜的pH用于保证一些对酸碱敏感的农药可以有好的回收率。

常用的吸附剂有PSA/C18/GCB等，其中C18和GCB主要清除脂类和色素等非极性物质，PSA通过极性、阴离子交换作用力吸附除去极性较强的杂质，如糖类、脂肪酸、有机酸、多酚等。由于西洋参药材成分复杂，在前处理时有效地除去非目标物质，可防止假阳性的产生，本研究选择PSA 400 mg + C18400 mg作为吸附剂。

综上所述，本实验采用乙腈作为提取溶剂，经QuEChERS 方法提取、净化西洋参中的腐霉利，选取 PSA 400 mg + C18400 mg作为吸附剂，对西洋参中残留腐霉利进行GC-MS分析。结果表明，GC-MS法测定西洋参中的腐霉利快速简便，重复性和灵敏度均较好，在对市场中西洋参的腐霉利残留量进行检测的同时，也可为中药西洋参市场监督提供一定的技术支持。