盐析辅助液液萃取/高效液相色谱－串联质谱法测定渔业水体中的7种喹诺酮类抗生素

杨 霄，刘伶俐，李小玲，肖 维，陈湘艺，谢仲桂*

（1. 湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153；2. 农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙），湖南 长沙 410153）

喹诺酮类（Quinolones，QNs）抗生素是人工合成的广谱类抗生素药物，具有抗菌谱广、价格低、耐药性低等特点，被广泛应用于临床治疗、畜牧和水产养殖等领域。该类抗生素被人和动物摄入后大部分以原药和代谢物形式随生物粪便和尿液排出体外，通过淋溶、渗透等多种途径进入地表水、地下水及土壤中，对生态系统造成污染［1－2］。喹诺酮类抗生素在水产养殖中应用广泛，其对水生动物细菌性感染具有良好的药物动力学特性和防治效果［3］。该类抗生素施用后，只有少部分被水产动物吸收，大部分进入水体、底泥等环境介质中，不仅会刺激环境中的病原菌产生耐药性，对水生生态系统安全产生负面效应，而且还会通过食物链富集作用影响人类健康［4］。

渔业水体中喹诺酮类抗生素种类繁多，含量很低（通常为ng/L 级别）［5］，对其含量进行检测可为水质监测和水体中抗生素的分布状况、迁移规律、降解动态等研究提供技术支撑。目前，渔业水体中喹诺酮类抗生素检测尚无国家或地方标准，现有的检测方法主要为高效液相色谱法［6－7］和高效液相色谱－串联质谱法［8－9］。高效液相色谱－串联质谱法的灵敏度高、特异性强，广泛用于渔业水环境中的抗生素检测。盐析辅助液液萃取（SALLE）是一种操作简单快速、萃取效率高的前处理技术，其影响因素主要为有机萃取剂和盐析剂，常用的萃取剂为甲醇、乙醇、乙腈等水溶性、毒性小的有机溶剂，盐析剂为硫酸镁、氯化钠、硫酸铵、氯化铵、甲酸铵、乙酸铵等环境友好的盐类。目前，SALLE在蜂蜜、血浆、白酒、水产品、婴幼儿食品、鱼类和肉类等样品的有毒有害物质残留检测中应用较多［10－15］，但在环境水体中农药［16－17］和抗生素［18］检测中的应用鲜有报道。Gezahegn 等［18］建立了一种以硫酸镁辅助乙腈盐析萃取结合高效液相色谱测定环境水体中环丙沙星的分析方法。该方法的线性范围宽、回收率高、操作简便快速、环境友好，在环境水体中抗生素残留检测方面具有潜在的应用价值。在已有文献的基础上，本文以乙腈为萃取剂，硫酸镁为盐析剂，采用SALLE 技术，结合高效液相色谱－串联质谱（HPLCMS/MS），建立了一种简单、快速、高效测定渔业水体中环丙沙星等7种喹诺酮类抗生素的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access 高效液相色谱－串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）；旋涡混匀仪（美国Scilogex 公司）；氮吹仪（美国Organomation 公司）；AB135－S 精密电子天平（梅特勒－托利多公司）；超纯水仪（中沃水务环保科技有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC 级，i国Merck 公司）；甲酸（LC－MS 级，美国Sigma 公司）；丙酮（HPLC 级，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸铵（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化钠（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）；硫酸镁、盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水（18.25 MΩ·cm）。

环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、培氟沙星（PEF）、诺氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、氟罗沙星（FLE）标准品均购自i国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各喹诺酮类标准品10 mg（精确至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L 的标准储备液，于－20 ℃避光保存。实验时，将上述标准储备液以20%（体积分数）甲醇水溶液稀释，配制成不同质量浓度的混合标准工作液。

1.3 样品处理

量取10 mL 水样至50 mL 离心管中，用稀盐酸调至pH 3.0 ± 0.05，加入5.0 mL 乙腈，涡旋混匀30 s。再加入3.5 g 硫酸镁，涡旋混匀5 min 使其充分溶解，以6 000 r/min 离心5 min，使样品溶液与乙腈相完全分层。将上层有机相全部转移至10 mL 离心管中，40 ℃氮气吹至近干，加入0.50 mL 20%甲醇水溶液，涡旋混匀30 s，过0.22 μm滤膜，滤液待测定。

1.4 色谱－质谱条件

1.4.1 色谱条件 Waters Atlantis C18色谱柱（150 mm × 2.1 mm，3.0 μm）；柱温为30 ℃；流速为0.25 mL/min；进样量为10 μL；流动相：A为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～9.0 min，20%～80% B；9.0～11.0 min，80% B；11.0～12.0 min，80%～20% B；12.0～13.0 min，20%B。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子模式，选择反应监测（SRM）；喷雾电压为3 500 V；离子传输毛细管温度为300 ℃；蒸发温度为350 ℃；鞘气压力为40 Arb，辅助气压力为10 Arb，碰撞气压力为199.983 MPa。优化后的其他质谱采集参数见表1。

表1 7种喹诺酮的色谱保留时间与质谱参数Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for seven quinolones

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本实验采用的Waters Atlantis C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）具有柱内径和填料粒径小、分离度高等特点，是HPLC 分离中的通用型色谱柱，适用于多种药物残留分析。喹诺酮类化合物在甲醇－水体系中的响应值较高，在水相中加入0.1%甲酸可改善目标物峰形，提高目标物的离子化效率。考虑到目标分析物的化学性质差异较大，采用梯度洗脱程序可有效缩短分析时间，并去除样品溶液中残留的杂质。综合考虑，实验最终选择甲醇－0.1%甲酸水溶液作为流动相，采用“1.4.1”的梯度洗脱程序进行检测。7 种喹诺酮类药物标准溶液（5 μg/L）的SRM色谱图见图1。

图1 7种喹诺酮类药物标准溶液（5 μg/L）的SRM色谱图Fig.1 SRM chromatograms of the seven quinolones standard solution（5 μg/L）

2.2 质谱条件的优化

喹诺酮类药物的化学结构含有羰基等富电子基团，易在电喷雾离子源正离子模式（ESI+）下产生［M+H］+分子离子。采用流动注射进样方式，以10 μL/min的流速将500 μg/L的7种喹诺酮类药物混合标准溶液注入离子源中。在正离子模式下分别对单个喹诺酮类药物进行一级质谱扫描，获得目标物的分子离子峰（［M+H］+），选取各化合物的［M+H］+为母离子，优化喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子传输毛细管温度等参数。然后利用二级质谱全扫描收集各药物母离子对应的子离子信息，分别选取相对丰度最强和次强的子离子作为定量离子和定性离子，并优化碰撞能。最终确定的质谱条件如“1.4.2”所述。

2.3 SALLE方法的优化

2.3.1 水样pH值的影响 喹诺酮类药物的化学结构中含有羧基和叔胺基官能团，属于两性、极性化合物。对于可电离的极性化合物而言，样品溶液的pH值直接影响待测物的电离状态和溶解性，从而对其萃取效率产生重要影响［18－19］。实验考察了不同pH值对目标物萃取效率的影响。以空白水样为基底，用稀盐酸分别调节pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，然后加入10 μg/L 的喹诺酮类抗生素混合标准溶液，混匀后按照“1.3”方法进行处理，结果发现，pH 3.0时目标化合物的回收率较高，重现性较好。因此，实验选择水样pH值为3.0。

2.3.2 萃取剂的优化 萃取剂是影响萃取率的关键因素。SALLE 的萃取剂一般需满足以下条件：①密度小于水且可与水混溶；②对目标物的萃取能力强；③加入盐析剂后，样品溶液与萃取剂分层良好，便于收集萃取剂层。实验考察了乙腈、甲醇和丙酮3 种与水互溶的常用有机溶剂的萃取性能。结果表明，加入盐析剂硫酸镁后，乙腈与样品溶液分层良好且盐析剂完全溶解，而甲醇和丙酮与样品溶液未出现明显分层且盐析剂溶解不完全。因此，实验选择乙腈作为萃取剂。

同时考察了不同体积（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL）的萃取剂乙腈对萃取剂与样品溶液分层效果和目标物回收率的影响（见图2）。结果表明：萃取分层后乙腈相的体积随着乙腈用量的增加而增大。当乙腈用量为1.0～5.0 mL 时，目标物的萃取回收率随着乙腈体积的增加而逐渐增大，当乙腈用量大于5.0 mL 时，目标物的回收率随着乙腈体积的增加几乎不变。为节省有机溶剂和缩短分析时间，实验选择乙腈的体积为5.0 mL。

图2 萃取剂体积对7种喹诺酮回收率的影响（n=3）Fig.2 Effect of the extraction solvent volume on the recoveries of seven quinolones（n=3）

2.3.3 盐析剂的优化 盐析剂是影响萃取率的重要因素。SALLE 的盐析剂一般需满足以下要求：①盐析剂难溶于萃取剂（提取溶剂）；②盐析剂在水中的溶解度足够大，以使盐析作用最大化。考察了4种常见的盐析剂（硫酸镁、硫酸铵、氯化钠和甲酸铵）对目标化合物的萃取效率。结果表明，硫酸镁作为盐析剂时，萃取剂和盐析剂的分层效果最好，目标物的萃取回收率最高，这可能是由于镁离子的离子电位高，盐析作用更强，能更好地提高SALLE 的萃取效率［20］。因此，实验选择硫酸镁作为盐析剂。进一步考察了硫酸镁的用量（1.5、2.5、3.5、4.0、4.5 g）对SALLE 富集效应和萃取效率的影响。结果发现，当硫酸镁的用量在1.5～3.5 g 递增时，萃取后乙腈相的体积增大，目标物的萃取回收率增加；当硫酸镁的用量在3.5～4.5 g 递增时，萃取后乙腈相的体积变化不大，目标物的萃取回收率几乎不变。因此，实验选择硫酸镁的用量为3.5 g。

2.3.4 涡旋混合时间的影响 涡旋混合影响目标物的萃取动力学过程。一方面，涡旋混合可加速盐析剂在水相的溶解；另一方面，涡旋混合增强了乙腈与水溶液间的接触，有利于两相体系的形成［16］。传质是一个与时间有关的过程，因此涡旋混合时间对目标物的萃取效率有重要影响［18］。实验考察了涡旋混合时间为1～9 min时对目标物萃取回收率的影响，结果发现，当涡旋混合时间为5 min时，盐析剂在水相中溶解完全，各目标化合物的回收率均较高。因此，选择最佳的涡旋混合时间为5 min。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

用初始流动相将喹诺酮类抗生素混合标准储备液（100 mg/L）稀释配制成6个浓度系列的混合标准工作溶液，按照优化后的仪器条件进行测定。采用外标法定量，以待测组分的质量浓度（x，μg/L）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。采用在空白水样中添加低浓度目标组分的方法，以信噪比S/N=3和S/N=10分别确定各组分的检出限和定量下限。结果表明，7种喹诺酮类抗生素在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）大于0.995，方法的LOD 和LOQ 分别为3～10 ng/L 和10～25 ng/L（见表2）。

表2 7种喹诺酮药物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of seven quinolones

2.5 回收率与相对标准偏差

在空白水样中分别添加3个不同浓度水平的喹诺酮类药物混合标准溶液，按本方法进行回收率实验，每个水平重复测定6 次，结果如表3 所示。7 种喹诺酮的平均回收率为77.8%～104%，相对标准偏差（RSD）为3.1%～10%，表明该方法的准确度和精密度好，满足渔业水体中喹诺酮类抗生素的检测要求。

表3 空白样品添加7种喹诺酮的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of seven quinolones spiked in blank samples（n=6）

2.6 与其他方法的比较

表4为本方法与国内外已报道的水体中喹诺酮类药物检测方法的比较。由表4可知，本方法具有线性范围宽、检出限低和回收率高等优点。更为重要的是，本方法的水样取样量少，萃取剂毒性低且用量更少，对环境更友好。这表明本方法具有较好的应用前景，可作为一种简便、快速、高效检测水体中痕量喹诺酮类抗生素残留的新方法。

表4 本方法与其他检测水体中喹诺酮类药物方法的对比Table 4 Comparison of the proposed method with other reported methods for determination of quinolones in water samples

2.7 实际样品检测

为验证方法的可靠性和实用性，采用优化的前处理方法和仪器条件对湖南省某市抽取的池塘水、湖泊水和水库水共20 份水样进行分析。结果表明，有4 份水样检出恩诺沙星（质量浓度为10.6～35.2 ng/L），1份水样检出氧氟沙星（质量浓度为13.8 ng/L）。

3 结 论

本文采用SALLE和HPLC－MS/MS技术，建立了一种同时测定渔业水体中7种喹诺酮类抗生素的分析方法。该方法灵敏度高、选择性好，操作简便快速。将此方法应用于实际样品检测，结果表明，部分渔业水体受到抗生素的污染。