人体毛发中氯胺酮及其代谢物的超高效液相色谱－串联质谱法检验及含量统计分析

侯 伟，张蕾萍，王继芬，魏春明，卢 亮，仲利静，刘浩田

（1.中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038）

氯胺酮（Ketamine，KET）自20 世纪60 年代发现以来，在较长一段时间内作为一种麻醉药物被广泛用于人类和动物医学中，同时由于其止痛作用，小剂量氯胺酮也被应用于治疗急慢性疼痛和抑郁症［1－2］。氯胺酮作用于人体后会起到分离麻醉效用，产生一种与环境和自身分离的感觉［3］，这种特殊的麻醉效果导致使用者对其产生依赖性，进而逐步发展成为世界范围内滥用最严重的毒品种类之一。氯胺酮可在人体肝脏中进行细胞色素P450亚型代谢，在代谢过程中，氯胺酮在酶的作用下发生去甲基化反应生成去甲氯胺酮（Norketamine，NK），再进一步羟基化形成羟基去甲氯胺酮（Droxynorketamine，HNK）［4］。在Ⅱ相代谢过程中，羟基去甲氯胺酮进一步与葡萄糖醛酸结合，之后由肾脏排出［5］。

目前，国内外对于氯胺酮和去甲氯胺酮的研究较为丰富，通常采用气相色谱法和高效液相色谱－质谱联用法等对生物体液中的氯胺酮及其代谢物进行检验［6－8］，但血液、尿液等生物体液样本的检测时效较短，不易采集和保存，难以反映受试者在数周乃至数月内的吸毒情况。另外，较少有对生物检材中的氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮同时进行检验分析的研究，目前仅Lisa等［9］和Hasan等［10］开展了人体血液中3 种物质同时检验的研究，对于毛发检验领域的此类研究相对匮乏。而作为一种新型生物检材，毛发具有其他生物检材所不具备的特殊优势，如易于采集和保存、不易掺假、检测周期长、吸毒信息反映全面等［11－12］，自公安部2018年颁布《涉毒人员毛发样本检测规范》［13］后，毛发检验在法庭科学检验领域的作用愈发关键，正逐步成为公安机关打击和监督毒品犯罪的重要依托，因此开展毛发样本中氯胺酮及其代谢物的研究具有非常重要的理论和实践意义。

基于此，本研究建立了一种高动能研磨结合超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）检验毛发中氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的方法，优化了毛发的清洗和提取过程，同时采用建立的方法检测毛发样本，得到人体毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的含量数据，并结合统计学方法对数据进行分析处理，研究吸食者毛发中氯胺酮及其代谢物的含量分布规律，为基层公安处理相关涉毒案件提供理论支撑与方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Shimadzu 30A UPLC超高效液相色谱仪、AUW120D电子天平（日本岛津公司）；Q－TRAP 5500串联质谱联用仪（美国AB Sciex 公司）；纯水仪（美国Millipore 公司）；台式高速冷冻离心机（i国Sigma 公司）；球磨仪（北京万孚智能科技有限公司）；HGC－12型氮吹仪（美国PerkinElmer公司）。

1 mg/mL 的氯胺酮（KET）、去甲氯胺酮（NK）和羟基去甲氯胺酮（HNK）标准品均购于美国Supelco 公司；用甲醇稀释后得到0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL 3种物质的混合标准溶液。

甲酸、甲酸铵（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；丙酮、正己烷、二氯甲烷、盐酸、十二烷基硫酸钠、四硼酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

准确称取0.2 g 十二烷基硫酸钠固体加入100 mL 纯水中制得0.1%十二烷基硫酸钠溶液；向49 mL甲醇中加入1 mL盐酸制得2%的酸性甲醇试剂；称取0.382 g四硼酸钠固体加入100 mL纯水中制得硼砂缓冲液（pH 9.0）。

毛发样本采集自浙江和云南近3 个月以来吸食过氯胺酮的志愿者，所有志愿者进行毛发样本采集前均已签订知情同意书。采集方法为用干净剪刀从靠近头皮的后枕部顶点处剪下一绺头发，使用锡箔纸包裹以防止静电，置于纸质信封中并标明采集者信息和毛发生长方向。收集头发样本后，记录每名志愿者的相关信息，包括姓名、性别、年龄、吸毒史和头发烫染情况等。空白头发样本取自无药物使用史的受试者后枕部头发。所有样品均在室温下保存于样品袋中，待分析。

1.2 样品前处理

准确称取50 mg头发样品于15 mL离心管中，分别加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠水溶液、5 mL超纯水和5 mL 丙酮，每种试剂各洗涤2 次，每次清洗1 min。收集最后一次洗涤溶剂氮气吹干并用1 mL甲醇复溶，待UPLC－MS/MS检测。

将洗净的头发从离心管中取出，置于通风橱中晾干。用剪刀将头发剪成2～3 mm 左右小段，准确称取20 mg 头发并置于专用研磨管内，再加入1 mL 甲醇，振荡混匀。使用球磨仪以3 000 r/min 研磨3 min，超声处理2 h，取500 μL 研磨液于离心管中，以4 000 r/min 离心5 min，上清液经0.22 μm 有机膜过滤，待UPLC－MS/MS分析。

1.3 色谱－质谱条件

1.3.1 色谱条件 选用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，柱温35 ℃，进样量5 μL。流动相：A 为含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸铵水溶液，B 为甲醇，流速0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～1.0 min，5%B；1.0～1.1 min，5%～20%B；1.1～3.0 min，20%～70%B；3.0～4.0 min，70%～95%B；4.0～6.0 min，95%B；6.0～6.1 min，95%～5%B；6.1～7.0 min，5%B。

1.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源正离子扫描模式（ESI+），多反应监测扫描模式（MRM）；离子源电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）压力：35 MPa；雾化气（GS1）压力：55 MPa；辅助气（GS2）压力：60 MPa。氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的质谱参数见表1。

表1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的质谱参数Table 1 Mass parameters of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验考察了甲醇、乙腈和0.1%甲酸乙腈为有机流动相时对3种待测物峰形的影响。结果显示：以0.1%甲酸乙腈为有机流动相时，氯胺酮和去甲氯胺酮的色谱峰峰形较差，并产生双峰现象；以乙腈为有机流动相时，3种待测物的响应较低，且羟基去甲氯胺酮的峰形较差，因此实验最终选择使用甲醇为有机流动相，并与含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸铵水溶液组成流动相进行后续实验。优化色谱条件下的氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮（质量浓度均为2 ng/mL）的总离子流图见图1，3个化合物的分离良好，峰形尖锐对称。

图1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的总离子流图（2 ng/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine（2 ng/mL）

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 清洗程序的选择 毛发的清洗程序是前处理过程的重要环节，能够清除毛发表面的污渍，避免其它杂质干扰检测结果，然而渗透性过强的试剂在清洗过程中可能会造成待测物流失，因此清洗试剂的选择非常重要。实验考察了6 种清洗方式对毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮检出效果的影响：不进行清洗处理（a），其余清洗程序均在超纯水清洗后，换用丙酮（b）、甲醇（c）、二氯甲烷（d）、0.1%十二烷基硫酸钠和丙酮（e）、丙酮和正己烷的混合溶液（体积比1∶1，f）各清洗2 次，每次1 min，所有试剂单次用量均为5 mL。将真实毛发样本平均分成18 份，每份50 mg，分别使用以上6 种清洗方式处理，每种方法平行3 次，按“1.2”方法处理并检测，取3 组平行样本的平均值为该方法下的标准值，最终得到6 种清洗程序后的真实毛发样本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的检出效果差异见图2。

图2 不同清洗方法对氯胺酮及其代谢物的检出效果影响Fig.2 Effects of different cleaning methods on the extraction of ketamine and its metabolites

由图可见，不同清洗方法会影响氯胺酮及其代谢物的检测结果，特别对于氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的影响较为明显。经过清洗处理后的毛发，氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的检出效果均优于未清洗的毛发，表明适当清洗可清除杂质而不造成此两种物质的过量损失，其中方法e 清洗后对氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的检出效果最佳，且去甲氯胺酮的效果相对较好，而经方法d处理后的效果最差，毛发中去甲氯胺酮的检出量甚至低于未经处理的样本，这可能是由于二氯甲烷在清洗过程中能够渗透进入毛发内部，使得其中部分去甲氯胺酮溶解在清洗液中，从而降低了去甲氯胺酮的检出量。综上，最佳清洗方法选择5 mL 的0.1%十二烷基硫酸钠溶液、超纯水和丙酮各清洗2 次，每次1 min。

2.2.2 提取程序的考察 考察了5种提取方法对毛发中氯胺酮及其代谢物检出效果的影响：①将干净毛发置于1 mol/L NaOH 溶液中，75 ℃水浴15 min，使用乙酸乙酯进行液－液萃取，萃取液在35 ℃氮气流下吹干并用初始流动相复溶，进样分析；②向装有干净毛发的离心管中加入1 mL甲醇直接超声2 h，离心过滤后进样分析；③向装有干净毛发的离心管中加入1 mL 甲醇并使用毛发研磨仪研磨，再超声2 h，离心过滤后进样分析；④向装有干净毛发的离心管中加入1 mL酸化甲醇（10 mL甲醇中含20 μL纯盐酸）进行研磨，超声2 h，离心过滤后进样分析；⑤加入1～2 mL 硼砂缓冲液（pH 9.0）并研磨，超声2 h，使用乙酸乙酯进行液－液萃取，萃取液在35 ℃温和氮气流下吹干并用初始流动相复溶，进样分析。将清洗完成后的毛发分为15份，每份20 mg，置于15 mL离心管中，分别使用上述5种方法进行提取处理，每种方法平行测试3 次，最终得到每种提取方法下真实毛发样本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的响应值。以每种提取方法下3组平行样本的平均值为其标准值，最终得到5种提取方法下3种物质的检出效果差异。

结果显示，在氯胺酮及其代谢物的提取过程中，使用碱消解和甲醇研磨超声辅助提取的效果最好，这是由于碱性溶液和研磨时高速粒子撞击使得毛发破碎较为完全，毛发中的物质得以充分释放；使用硼砂缓冲液进行提取的效果相对稍差，可能是因为萃取过程造成了待测物的损失；使用酸化甲醇研磨和甲醇超声的效果最差，这是由于氯胺酮及其代谢物属于偏碱性物质，使用酸化甲醇难以在短时间内进行有效提取，而直接进行甲醇超声无法破坏毛发的基本结构，因而难以将待测物充分释放。与甲醇研磨超声辅助提取法相比，碱消解虽然能够将毛发破坏得更彻底，但存在基质效应高、操作复杂等缺点，同时在萃取过程中会产生乳化现象，影响实验结果的准确性。综合考虑，选择甲醇研磨超声辅助提取作为毛发中氯胺酮及其代谢物的最佳提取方法。

2.3 方法学考察

2.3.1 工作曲线、检出限与定量下限 称取干净空白毛发8份，每份20 mg，分别置于8支研磨管中，使用移液枪向其中分别添加1 mL不同质量浓度（0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL）的氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的混合标准溶液并用氮气吹干，制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5 ng/mg 的系列加标样品，按“1.2”方法处理，进样检测后绘制氯胺酮及其代谢物的工作曲线（x为待测物浓度，y为对应峰面积），以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限（LOD），以S/N=10计算定量下限（LOQ），结果见表2。结果显示：3 种化合物在0.01～5 ng/mg 范围内线性良好，相关系数（r）均不低于0.996 2，LOD为0.005～0.020 ng/mg，LOQ为0.01～0.05 ng/mg。

表2 3个化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 3 compounds

2.3.2 基质效应、回收率与精密度 称取清洗后的空白毛发9 份，每份20 mg，分别置于9 支研磨管中，向其中分别添加1 mL 不同质量浓度（1、10、100 ng/mL）氯胺酮及其代谢物的混合标准溶液并在稳定氮气流下缓慢吹干，制成3 种物质含量为0.05、0.50、5.00 ng/mg 的毛发阳性样本，每个样本平行3 组，在优化条件下处理并测定，计算方法的回收率和基质效应［14］。制备同样浓度梯度样品在同一天内的早、中、晚3 个不同时间检测，计算氯胺酮及其代谢物峰面积的日内精密度（RSD）；连续测定3 d，计算日间RSD。结果显示：氯胺酮及其代谢物在优化条件下的回收率为86.7%～106%，基质效应为88.1%～99.6%，日内RSD 为0.72%～4.1%，日间RSD 为1.9%～6.3%（表3），表明方法的准确性及精密度良好，完全满足毛发中氯胺酮及其代谢物的检验要求。

表3 3个化合物的回收率、基质效应和精密度（n=3）Table 3 Recoveries，matrix effects and precisions（n=3）of 3 compounds

2.4 毛发阳性样本数据统计学分析

实验收集了50 份氯胺酮吸食者毛发样本，其中男性样本38 份，占样本总数的76%，女性样本12份，占样本总数的24%，采用建立的UPLC－MS/MS方法分析，结果见表4。

表4 毛发阳性样本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的含量Table 4 Content distribution of KET，NK and HNK in the positive hair samples

由表4 可见，50 份真实毛发样本中均检出氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮，含量分别为0.30～73.80 ng/mg（均值为8.84 ng/mg）、0.04～5.98 ng/mg（均值为1.05 ng/mg）和0.30～58.90 ng/mg（均值为8.91 ng/mg），其各自的分布情况如图3所示，其中横线及数字表示平均含量。

图3 毛发阳性样本中氯胺酮（A）、去甲氯胺酮（B）和羟基去甲氯胺酮（C）的含量分布情况Fig.3 Content distributions of ketamine（A），norketamine（B）and hydroxynorketamine（C）in the positive hair samples

由图可知，去甲氯胺酮的含量范围较窄，分布较为集中；而氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的含量范围较宽，整体呈现非正态分布，少部分毛发样本具有较高含量，从而明显拉高了含量均值，因此需采用分段统计的方法进一步分析。根据Musshoff 等［15］的分析方法，可将3 种物质的含量经由低到高的顺序排序后再按照百分位分段，各百分位的值和其他相关数据如表5所示。

表5 3个化合物的百分位值（p）、平均值、标准偏差（SD）、最小值和最大值Table 5 Percentile values（p）for 3 compounds，average，standard deviation（SD）and minimum and maximum values（ng/mg）

根据表5 中百分位分段统计可知，50 份真实毛发样本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的平均含量均高于（50%），分布明显偏斜。超过90%的样本中氯胺酮的含量不高于20 ng/mg，其中超过半数样本含量位于1～10 ng/mg 范围内，另外仅有不到10%样本中氯胺酮含量高于20 ng/mg，且分布较为分散；去甲氯胺酮在毛发中的含量低于氯胺酮且分布相对集中，标准偏差为1.33 ng/mg，近75%样本中去甲氯胺酮的含量低于1 ng/mg；羟基去甲氯胺酮在毛发中的含量分布与氯胺酮相似，多数样本含量低于20 ng/mg。

根据以上数据，结合向平等［16］的分段统计方法，可将毛发中氯胺酮及其代谢物的含量大致分为低、中、高3个层次，相关数据见表6，其中氯胺酮和羟基去甲氯胺酮均以1 ng/mg和10 ng/mg为划分节点，去甲氯胺酮则以0.2 ng/mg 和1 ng/mg 为划分节点。由于分段标准的差异会影响最终结果，本划分方法仅做参考。

表6 3个化合物在不同层次下的含量范围、平均值、样本数及所占比例Table 6 Content ranges，average values，sample numbers and proportions of 3 compounds at different levels

采用数据分析软件IBM SPSS Statistics 26 对50 份真实毛发样本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的含量进行相关性检验，结果发现去甲氯胺酮和氯胺酮、羟基去甲氯胺酮和氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮含量之间的皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient）分别为0.871、0.945 和0.913，表明三者间呈正相关，且相关性较为显著。其中羟基去甲氯胺酮与氯胺酮含量之间的相关性相对较高，由表4 数据可知两者间的含量比率均在1.00 上下浮动，表明两者在毛发中的含量较为相似；去甲氯胺酮与氯胺酮之间的含量比率在0.05～0.60之间，这与Salomone等［17］将两者间的最小浓度比设定为0.05这一研究结论较为契合。

由于个体在服用剂量、自身代谢、头发颜色、吸毒习惯等方面的差异，吸毒人员毛发中的氯胺酮及其代谢物的含量不尽相同，因此目前国内外对于毛发中氯胺酮及其代谢物的阳性认定阈值尚存在一定争议。本研究中50 份真实毛发样本中氯胺酮的最低含量为0.30 ng/mg，高于国际毛发分析协会（The society of hair testing，SOHT）和国内相关技术规范所建议的0.20 ng/mg 的阳性阈值，但低于Leung 等［18］和欧洲工作场所药物测试协会（European workplace drug testing society，EWDTS）［19］所建议的0.40 ng/mg 和0.50 ng/mg 的阳性阈值。本研究的含量数据可为氯胺酮及其代谢物的阳性阈值提供一定参考，但由于样本数量不足，尚难以提出确切的阈值建议。然而相关研究表明，碱性药物进入人体后，其中所含阳离子基团会与黑色素的羧基之间产生静电吸引作用，从而促进药物与毛发的结合，毛发中黑色素的含量越高，结合药物的能力越强［20］。根据该理论，中国人头发中的黑色素较国外部分人群更为丰富，相同条件下氯胺酮及其代谢物更容易与之结合并沉积，因此研究认为氯胺酮及其代谢物的阳性阈值应不低于国外相关权威标准，即不低于0.20 ng/mg。此外，由于毛发处理过程中可能会存在一定污染而造成假阳性结果，因此还需参考毛发中原药与代谢物的含量比率等数据来最终认定是否为阳性。

3 结 论

本研究建立了超高效液相色谱－串联质谱检验毛发中氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮的分析方法，并考察和优化了毛发的清洗程序，该方法简单、易于操作、回收率高、重现性好，能够满足基层公安对于毛发检材的检验要求。应用该方法检验了50份毛发样本，并对氯胺酮、去甲氯胺酮和羟基去甲氯胺酮在阳性毛发中的含量数据进行分段统计，获取了氯胺酮及其代谢物在不同含量区间的数据分布情况，初步分析了氯胺酮原药及其代谢物的含量关系和阳性阈值，该数据可为涉毒案件的办理以及后续研究吸毒人员毛发中的毒品含量提供借鉴和依据。