基于脂肪酸含量分析结合化学计量学的橄榄油等级鉴别方法

曾 静，伊雄海，曲 栗，2，郭德华，包 明，张 怡，陈珏颖

（1. 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2. 复旦大学 公共卫生学院，上海 200433）

橄榄油在地中海国家是一种经济价值很高的产品，在国际上因其具有丰富的脂肪酸，易被人体吸收，具有调节胆固醇、抗氧化、预防癌症、美容等功效而备受人们的青睐［1－2］。特级初榨橄榄油被认为是橄榄油的最高品质等级，其营养特殊、风味独特且具有保健功能，因此价格昂贵。但在利益的驱使下，一些不法商家以次充好，将非初榨橄榄油（如精炼橄榄油）冒充特级初榨橄榄油，或掺入其他种类的植物油或油橄榄果渣油，重新勾兑后冒充橄榄油，严重影响了消费者的健康［3－4］。

目前橄榄油掺伪鉴别主要以甾醇、脂肪酸、挥发性物质、蜡含量为目标物进行检测［5－11］，如Yang等［6］通过测定食用油中脂肪酸含量，成功地鉴别出掺有4种植物油的特级初榨橄榄油，张方圆等［12］采用气相色谱法测定食用油中脂肪酸含量，成功对6种食用油进行分类，Jabeur等［13］利用气相色谱法结合线性判别分析方法通过测定亚麻酸和反式脂肪酸含量完成橄榄油掺假的定性和定量研究，但这些研究报道仅针对于橄榄油中掺杂其他植物油，而未对特级初榨橄榄油和低等级橄榄油的等级鉴别进行相关研究。此外，Torrecilia 等［2］采用紫外检测结合化学计量学成功鉴别特级初榨橄榄油中掺假低等级橄榄油（精炼橄榄油、油橄榄果渣油），Quintanilla－Casas 等［14］将化学计量学结合顶空固相微萃取（HSAPME）和气相色谱－质谱法（GC－MS）测定橄榄油中挥发性物质，Mustorgi等［15］建立了化学计量学结合近红外光谱法测定特级初榨橄榄油品质的预测模型；娄婷婷等［17］建立了多种光谱技术结合化学计量学对食用油的分析鉴别方法，但这些光谱法只能给出整个指纹特征的相关信息，而不能得到其具体组成部分的信息。因此，建立一种基于橄榄油中特征组分鉴别特级初榨橄榄油和低等级橄榄油的方法具有重要意义。

化学计量学包括主成分分析（PCA）、k 邻近（kNN）线性判别分析、偏最小二乘判别分析（PLSDA）、聚类分析（HCA）和人工神经网络等方法。化学计量学方法不仅可降低数据维度，而且有助于对测量数据的解释、判别和预测［16］。近年来，随着化学计量学的发展，国内外将化学计量学结合色谱、光谱等方法用于鉴别橄榄油真伪的研究越来越多，如：韩建勋等［18］建立了傅里叶变换红外光谱结合化学计量学用于山茶油中掺杂大豆油的鉴别；相倩倩等［19］建立了光谱法结合化学计量学鉴别蜂蜜的真伪。

本文采用测定脂肪酸含量结合化学计量学法对特级初榨橄榄油和精炼橄榄油进行等级鉴别，应用气相色谱法（GC）分别测定初榨橄榄油和精炼橄榄油中的脂肪酸含量，通过主成分分析、聚类分析、偏最小二乘判别分析建立了橄榄油等级鉴别预测模型。本方法的建立弥补了现有研究中对特级初榨橄榄油和低等级橄榄油鉴别的缺乏，同时也解决了指纹图谱中仅获得整个指纹特征相关信息，而得不到具体组成部分信息的缺陷。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent7890A 气相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Vortex2 涡旋混合器（i国IKA 公司）；Allegia X－22R 高速冷冻离心机（Beckman 公司）；恒温水浴锅（欧莱博公司）；0.22 μm 有机相滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）；Million－Q Integral型超纯水系统（i国默克公司）。

37 种脂肪酸甲酯混合标准品（10 mg/mL，产品编号：47885－U，美国Supelco 公司）。甲醇、正己烷（色谱纯，美国Merk公司）；氢氧化钾（分析纯，国药集团药业股份有限公司）。4 mol/L氢氧化钾－甲醇标准溶液的配制：称取112 g氢氧化钾，用甲醇定容至500 mL，临用时现配。

实验样品主要包括16 种特级初榨橄榄油（EVOO）、26 种精炼橄榄油（ROO），均收集于进口及国外各橄榄油企业，经相关机构认定及实验证明其真实属性，这42种确认属性样品作为训练集，样品编号及真实属性等信息见表1。98 种未知属性的橄榄油样品作为测试集，用于验证模型的可靠性，包括72个特级初榨橄榄油样品和26个精炼橄榄油样品。

表1 橄榄油样品的信息Table 1 Information of olive oil samples

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸甲酯的测定 准确称取0.1 g（精确至0.01 g）样品于50 mL具塞试管，加入5 mL正己烷，涡旋振荡1 min，加入200 μL 4 mol/L氢氧化钾－甲醇溶液，剧烈振摇30 s，静置澄清后，加入10 mL去离子水，振摇，于4 000 r/min下离心5 min，取上层清液，过膜，待GC－FID分析测定。

1.2.2 仪器条件 色谱条件：色谱柱（氰丙基聚硅氧烷强极性固定相）：SP－2560 色谱柱（100 m ×0.25 mm，0.2 μm，Supelco 公司）；进样口温度：280 ℃；检测器温度：280 ℃；程度升温：100 ℃（保持3 min），以10 ℃/min 升至180 ℃（保持3 min），以1 ℃/min 升至200 ℃（保持10 min），以4 ℃/min 升至230 ℃（保持5 min）。进样体积：1 μL；分流比：100∶1，载气：氮气。

1.2.3 数据处理 采用Metaboanalyst5.0 软件对测得数据进行预处理、独立样本t检验、PCA、HCA和PLS－DA分析，并通过交叉验证方式验证模型的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

比较了DB－WAX（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）、HP－88（100 m × 0.25 mm，0.2 μm）和SP－2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）3种色谱柱对37种脂肪酸甲酯的分离效果。结果表明，DB－WAX色谱柱对顺反式异构体的分离效果差，有4 组化合物（C18∶ln9c/C18∶ln9t；C18∶2n6c/C18∶2n6t；C20∶3n6/C21∶0；C22∶6/C24∶1）共流出，表明此色谱柱不适用于复杂橄榄油样品中脂肪酸甲酯的分离；HP－88色谱柱能够很好地分离顺反式异构体，但有1组化合物（C22∶0/C20∶3n6）共流出，表明此色谱柱对复杂样品（如氢化植物油）有较好的分离效果，也适用于橄榄油样品；SP－2560（100 m × 0.25 mm，0.2 μm）是一种强极性的色谱柱，其固定相成分为100%氰丙基聚硅氧烷，此色谱柱能够很好地分离37种脂肪酸甲酯，且无化合物共流出现象，适合橄榄油样品中脂肪酸甲酯的分离，本实验选用SP－2560色谱柱进行分离。图1为37种脂肪酸甲酯在SP－2560色谱柱上的分离情况。

图1 37种脂肪酸甲酯标准品的色谱图Fig.1 Chromatogram of 37 mix fatty acids methyl ester standard

2.2 两种等级橄榄油中脂肪酸甲酯含量的测定

分别对确认属性的42 个橄榄油样品进行脂肪酸甲酯含量的测定，共测出37 种脂肪酸甲酯，其中22种脂肪酸甲酯含量小于检出限。表2给出了含量大于检出限的平均值和标准偏差，由表可知，除C18∶2n6t 外，其余脂肪酸在两种等级的橄榄油中含量相差不大，一般的统计分析方法很难对两种等级橄榄油进行鉴别。而C18∶2n6t 在特级初榨橄榄油中均未检出，在部分精炼橄榄油中未检出（如：编号64、70、213 均未检出C18∶2n6t），其原因除了受加工过程的影响外，橄榄油的产地也可能是影响因素。因此，不能只以该脂肪酸作为鉴别特级初榨橄榄油和精炼橄榄油等级的指标，还需结合其他具有差异性的特征指标鉴别两种等级橄榄油。

表2 两种等级橄榄油中各脂肪酸甲酯的含量（%）Table 2 Contents of fatty acid methyl ester in two grades of olive oils（%）

2.3 鉴别两种等级橄榄油的化学计量学分析

2.3.1 主成分分析（PCA） PCA 是一种无监督的模式识别方法，通过对错综复杂的数据进行降维，筛选能重现的数据信息，并以几个主成分的形式对原始数据进行可视化，以集中典型地表征原变量的数据特征，从而充分反映总体信息［20－21］，目的是寻找最能解释数据集（X）中方差的方向，而不需要参考类别标签（Y）。本文采用Metaboanalyst5.0软件对表2的数据进行预处理后，进行主成分分析。特级初榨橄榄油和精炼橄榄油的PCA结果如图2所示。A和B表示经两种不同预处理方式（A：各变量最小正值的1/5 替换缺失值；B：各变量最小正值的1/5 替换缺失值后，进行归一化处理）得到的PCA 得分图。由图可知，未经归一化预处理的数据，得到的PCA 图中两种等级橄榄油的主成分存在重叠现象，不能很好地分开，而经归一化处理后得到的PCA 图中，特级初榨橄榄油和精炼橄榄油各聚为一类，具有明显的聚集区域，其中第一主成分和第二主成分的贡献率分别为58.5%和14.9%，累计贡献率为73.4%。这是由于归一化处理使得同一样品不同属性间或同一属性间在不同样品内的方差减小。因此，本方法采用对数据进行归一化预处理后再进行主成分分析。

图2 两种等级橄榄油的PCA得分图Fig.2 PCA score plots for grade identification of two kinds of olive oils

图3为经归一化预处理后得到的两种等级橄榄油的PCA 载荷图，由图可知，C23∶0（14）、C18∶2n6t（8）、C24∶0（15）等组分的载荷图与图2B 中精炼橄榄油所处位置相似，表明其在精炼橄榄油中的含量高于特级初榨橄榄油。C18∶1/C18∶2（18）、C20∶1（11）、C18∶1n9c（7）等组分的载荷图与图2B中特级初榨橄榄油位置相似，因此这些脂肪酸在特级初榨橄榄油中的含量较高，这与表2结果一致。

图3 两种等级橄榄油的PCA载荷图Fig.3 PCA load chart for grade identification of two kinds of olive oils

2.3.2 聚类分析（HCA） HCA是依据观察对象的某些特征加以归类的数理统计方法。本研究将原始数据经过缺失值替换，并作归一化处理后进行聚类分析，得到热图（见图4）。图中每行代表一种化合物，含量从低到高由蓝色到红色，两种等级橄榄油被清晰的分成两组，且分类正确。因此，可采用HCA 方法区分特级初榨橄榄油和精炼橄榄油。

图4 两种等级橄榄油脂肪酸的聚类分析热图Fig.4 Cluster analysis heat map of two grades of olive oils based on fatty acids

2.3.3 偏最小二乘法判别分析（PLS－DA） PLS－DA是一种有监督的识别方法，因其所建的模型比较稳定，且具有很强的抗干扰能力，因此是目前应用最为广泛的定量建模方法。图5 为两种等级橄榄油的PLS－DA 二维模型，由图可知，PLS－DA 模型的分类结果与PCA 分析结果类似，样品组内得到较好的聚类效果，能清晰明确地对特级初榨橄榄油和精炼橄榄油进行分类。图6 是变量权重的重要性排序（VIP）图，其中VIP值越大，说明该变量对分类的贡献越大，通常选择VIP值大于1的变量，由图6知，C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1和C18∶1n9c对模型的贡献较大。

图5 两种等级橄榄油的PLS－DA模型图Fig.5 PLS－DA models of two grades of olive oils based on fatty acids

图6 PLS－DA模型的VIP值Fig.6 VIP value of PLS－DA model

由于PLS－DA 是一种有监督的模式判别方法，易出现过度拟合风险，因此，需对建立的模型进行交叉验证（Cross validation，CV）。交叉验证中，可预测指标（Q2）用于估计模型的预测能力，Q2值越接近1，说明模型的预测能力越好。本方法采用98 个橄榄油样品作为验证集对建立的模型进行交叉验证。表3 和图7 给出了以十折交叉验证（CV）得到的模型验证结果。从图7 可知，前5 个组分（C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1）模型的相关系数（R2）在0.96 ～0.99之间，Q2在0.96 ～0.97之间。由表3可知，特级初榨橄榄油（EVOO）的预测准确率为97.2%，精炼橄榄油（ROO）的预测准确率为100%。综上可知，本方法所建立的预测模型可靠性较高。

图7 PLS－DA模型的十折交叉验证结果Fig.7 10 times cross validation results of PLS－DA model

表3 PLS－DA模型的交叉验证结果Table 3 Cross validation result of PLS－DA model

3 结 论

本文通过GC 法测定橄榄油中脂肪酸含量，并结合化学计量学法，有效地区分了特级初榨橄榄油和精炼橄榄油。原始数据经空值替换后经归一化处理得到的PCA 得分图效果明显优于未经归一化处理得到的PCA 效果；同时对归一化处理的数据分别进行了PCA、HCA 和PLS－DA 3 种化学计量学方法的分析。结果表明，该3种方法均能有效地对两种等级橄榄油进行正确分类；通过VIP值，最终确认C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1和C18∶1n9c等6种组分作为两种橄榄油等级鉴别的特征组分。经交叉验证，建立的PLS－DA 模型具有较好的预测能力。结果表明，基于脂肪酸含量分析结合化学计量学法可作为鉴别两种等级橄榄油的有效手段，为橄榄油的真实性鉴别提供了理论和科学依据。