胶质瘤MAGE-D4剪接变体ab和c的表达及临床意义*

张庆梅，罗 鑫，刘 畅，闭水清，葛盈盈 罗 彬，谢小薰，肖绍文，赵文婧，沈 宁

广西医科大学 1组织学与胚胎学教研室 2基础医学中心实验室，南宁 530021 3广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁 530021 4广西壮族自治区人民医院口腔颌面外科，南宁 530021

mRNA选择性剪接是高等真核生物体内普遍存在的一种从转录后水平调控基因表达的重要方式[1-2]，正常的剪接方式在机体不同发育阶段、不同环境的生理需要中起着重要的作用[3-4]，而异常的剪接方式被认为与许多疾病，尤其是肿瘤密切相关[2，5-6]。

黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)是一个多基因的大家族，因第1个成员首先在黑色素瘤中发现而得名，可分为A、B、C、D、E、F等亚家族。MAGE-D4是2001年Sasaki等[7]鉴定出的一个MAGE家族新成员，由13个外显子和12个内含子组成，研究报道MAGE-D4 mRNA前体在转录后加工过程中，可在第2外显子5′末端90 bp、第3外显子中间411 bp和第12外显子3′末端12 bp处发生选择性剪接，产生MAGE-D4a、MAGE-D4b和MAGE-D4c等3种剪接变体[7]，其中MAGE-D4a mRNA在上述3个外显子处均发生剪接，MAGE-D4b mRNA仅在第2、3外显子处发生剪接，第12外显子处被保留；MAGE-D4c mRNA在上述3个外显子处均未发生剪接。这3种剪接变异体在翻译时享用同一个ATG，但终止密码却不同，因此编码的3种产物N端的348个氨基酸相同，C端的氨基酸不同。其中MAGE-D4a蛋白与MAGE-D4b相似，仅在C末端比MAGE-D4b多2个氨基酸，且二者均含有MAGE家族同源结构域(MAGE homology domain，MHD)；MAGE-D4c蛋白缺少C端的大部分区域，具有一个独特的66个氨基酸尾部，且缺少MHD。

目前关于MAGE-D4 mRNA剪接变体的文献报道仅发现1篇[7]，该文献报道显示MAGE-D4ab(MAGE-D4a或/和MAGE-D4b)在胶质瘤中表达丰富，而MAGE-D4c则在所检测的多种肿瘤组织中均有表达，提示MAGE-D4ab与胶质瘤的关系密切。但仔细回顾文献我们发现，该研究用于检测MAGE-D4c的RT-PCR引物设计有缺陷，即引物位置没有跨内含子，使用这一引物进行PCR扩增时，难以避免因样品中DNA污染而导致MAGE-D4c假阳性结果。另外，该研究只检测了6例胶质瘤标本，未设正常脑组织作为对照，因而其结果难以客观地反映MAGE-D4剪接变体的表达情况。因此我们重新设计引物，扩大胶质瘤样本数，同时使用非肿瘤脑组织作为对照，以期通过本研究进一步了解胶质瘤中MAGE-D4剪接变体的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本和临床资料收集

89例胶质瘤标本和24例非肿瘤的脑组织均来源于广西医科大学第一附属医院2008年6月至2012年6月的手术患者。胶质瘤患者男56例，女33例，年龄2～78岁，平均(36.5±17.2)岁；所有组织均经资深病理专家诊断证实，其中包括51例星形细胞瘤、3例间变性星形细胞瘤、25例胶质母细胞瘤，6例少突胶质细胞瘤、2例少突星形细胞瘤和2例节细胞性胶质瘤。按WHO中枢神经系统肿瘤分级标准[8]，低级别(Ⅰ～Ⅱ)59例，高级别(Ⅲ～Ⅳ)30例。手术切除离体后的标本迅速置液氮速冻，然后移至-80℃低温冰箱保存备用。以上所有组织标本的收集均获患者知情同意和广西医科大学伦理委员会的批准。

1.2 MAGE-D4剪接变体引物设计及评价

目前已知MAGE-D4的3种剪接变体中，MAGE-D4a和MAGE-D4b的差异仅为3′末端的12 bp，难以设计合适引物区分MAGE-D4a和MAGE-D4b，故本研究所设计引物只能用于区分MAGE-D4ab和MAGE-D4c。首先从GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)获取MAGE-D4ab和MAGE-D4c mRNA序列，进行Blast序列同源性比较，获知MAGE-D4基因高度保守序列，结合MAGE-D4ab和MAGE-D4c mRNA序列差异，选择适合扩增的片段序列输入Primer premier 5.0软件设计引物，选择排名靠前和跨内含子的引物，利用Oligo 6.0评价引物，将引物在GenBank中进行特异性回检，最后选定引物。引物序列为：上游引物5′-CAGGATGGGAGGCAAGAGGACC-3′，下游引物5′-CCAAGGAGGCGAGCTGAGGAGT-3′，引物位置和扩增片段见图1。

1.3 总RNA提取、cDNA合成和cDNA质量检测

50 mg组织迅速加入1 mL TRIzol试剂进行匀浆，然后加入氯仿，离心后吸取上层水相，加入预冷的异丙醇沉淀RNA，并用75%乙醇洗涤RNA，将RNA沉淀干燥后，加入适量DEPC处理水溶解RNA；采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测；取5 μg总RNA，按照Fermentas逆转录试剂盒说明书合成cDNA，然后通过扩增管家基因GAPDH来检测cDNA质量，GAPDH引物序列及扩增条件参照文献[9]。

1.4 MAGE-D4剪接变体引物特异性检测

分别以胶质瘤组织cDNA和基因组DNA为模板，采用上述新设计的引物进行PCR扩增，根据扩增条带和产物大小来检测引物的特异性。反应体系：ddH2O 16.05 μL，10×buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，TaqDNA polymerase 0.2 μL，DMSO 1.25 μL，cDNA 1 μL；反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后72℃充分延伸10 min。

空心框：外显子；水平箭头：本研究中使用的引物位置；水平虚线箭头：Sasak使用的引物位置；斜线框：可变剪接位点；1～13：外显子编号图1 MAGE-D4 mRNA剪接变体扩增示意图Fig.1 Schematic overview of MAGE-D4 mRNA alternative splicing amplication

1.5 MAGE-D4剪接变体扩增产物测序验证

取MAGE-D4剪接变体扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别切取400～500 bp和800～900 bp的条带，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收，回收后的产物与T载体连接，转入DH5α感受态细胞进行克隆培养后，将鉴定正确的菌液送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

1.6 MAGE-D4剪接变体的检测

以不同类型胶质瘤组织和非肿瘤脑组织cDNA为模板，采用上述特异性验证的引物进行PCR扩增，以多次检测为MAGE-D4阳性的cDNA为阳性对照，不加模板的双蒸水为空白对照，PCR反应体系及反应条件见上述1.4项。反应完毕取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶电泳成像分析系统下观察并拍照。

1.7 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数(百分率)[n(%)]表示，剪接变体表达率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAGE-D4剪接变体引物特异性检测

为检测本研究新设计引物的特异性，我们分别以DNA和cDNA为模板进行PCR，结果显示：以cDNA为模板扩增产物长度为500 bp和900 bp左右，分别与预计PCR产物MAGE-D4ab分子量465 bp、MAGE-D4c分子量876 bp接近；而以DNA为模板扩增产物长度则在1200～1500 bp之间。这说明我们新设计引物具有特异性，能排除扩增DNA所致的假阳性(图2)。

M：DNA Marker；1～4：胶质瘤组织cDNA；5：阳性对照；6：阴性对照；7～10：胶质瘤组织DNA 图2 MAGE-D4引物特异性检测电泳图Fig.2 Electrophoretogram of PCR to test the specificity of MAGE-D4 primers

2.2 MAGE-D4剪接变体扩增产物测序

随机挑取465 bp和876 bp PCR产物的阳性克隆进行测序，结果显示465 bp的PCR产物测序序列与GenBank中MAGE-D4a和MAGE-D4b mRNA序列匹配(图3A)，876 bp的PCR产物测序序列与GenBank中MAGE-D4c mRNA序列匹配(图3B)，这证实新设计的引物可特异性扩增MAGE-D4ab和MAGE-D4c。

A：MAGE-D4ab mRNA；B：MAGE-D4c mRNA；Query：测序序列；Sbjct：GenBank中MAGE-D4 mRNA部分序列图3 MAGE-D4剪接变体测序结果比对图Fig.3 Blast analysis of MAGE-D4 alternative splicing variants’sequences

2.3 胶质瘤中MAGE-D4剪接变体表达

为了解胶质瘤中MAGE-D4 mRNA的剪接模式，我们检测了89例不同病理类型的胶质瘤组织和24例非肿瘤的脑组织，结果显示：胶质瘤MAGE-D4ab的表达率(77.50%)明显高于脑组织(54.20%，P<0.05)，而MAGE-D4c的表达率(53.90%)与脑组织比较差异无统计学意义(50.00%，P>0.05)。从剪接变体的存在形式看，无论是在胶质瘤组织还是脑组织均存在两种形式：一是单独存在的MAGE-D4ab，以MAGE-D4ab-c表示，二是MAGE-D4ab和MAGE-D4c同时存在，以MAGE-D4ab+c表示(图4)；在胶质瘤中，MAGE-D4ab-c的表达率为23.6%，高于脑组织的MAGE-D4ab-c表达率(4.17%，P<0.05)，而MAGE-D4ab+c的表达率为53.93%与脑组织(50.00%)相比则差异无统计学意义(P>0.05)。

从表达量看，MAGE-D4ab的表达无论在胶质瘤组织还是脑组织均普遍较MAGE-D4c丰富(图4)。

图4 RT-PCR检测非肿瘤脑组织(A)和胶质瘤组织(B)中MAGE-D4 mRNA剪接变体Fig.4 Detection of MAGE-D4 mRNA alternative splicing variants in non-tumor brain tissues(A)and glioma tissues(B)by RT-PCR

2.4 MAGE-D4剪接变体表达与胶质瘤患者临床指标的关系

为了解MAGE-D4剪接变体在胶质瘤中表达的临床意义，我们分析了MAGE-D4剪接变体表达与胶质瘤临床病理参数的关系，结果显示MAGE-D4ab、MAGE-D4c、MAGE-D4ab-c和MAGE-D4ab+c的表达率均与胶质瘤临床资料无明显相关性(表1)。

表1 MAGE-D4ab、MAGE-D4c、MAGE-D4ab-c和MAGE-D4ab+c的表达率与胶质瘤临床病理资料相关性[例(%)]Table 1 Clinicopathological characteristics in relation to MAGE-D4ab，MAGE-D4c，MAGE-D4ab-c and MAGE-D4ab+c expression in glioma tissues [n(%)]

3 讨论

mRNA选择性剪接是真核基因表达调控研究的重要内容之一。高等真核生物基因组中绝大部分基因是断裂基因，其初级转录产物(pre-mRNA)也是断裂结构，需要进行加工才能成为成熟的mRNA。pre-mRNA在进行加工时剪接体可选择性地对其内含子或外显子进行剪接，从而将同一种pre-mRNA剪接成多种不同的成熟mRNA剪接变异体，进而翻译成具有不同生物学功能的蛋白质[10-11]，外显子(或内含子)剪接增强子、外显子(或内含子)沉默子等顺式作用元件和SR、hnRNP蛋白等反式作用因子相互作用可调控剪接变体的表达[12]。

选择性剪接在人类等高等生物中普遍存在，具有组织和发育阶段特异性，是机体满足各种发育阶段、各种生理环境需要的重要调控机制[3-4]。如果机体发生异常的剪接则可导致某些疾病，尤其是肿瘤[[2，5-6]。有研究显示剪切位点突变、顺式作用元件突变或反式作用因子异构等因素均可导致肿瘤相关基因pre-mRNA的异常剪接，从而导致肿瘤特异性剪接变异体的出现或相关基因剪接变异体的表达异常[13-14]。近年来越来越多的肿瘤异常剪接变异体被鉴定，它们与肿瘤发生、发展、转移的关系得到进一步证实[14-15]，它们在肿瘤诊断和治疗中的重要价值逐渐体现出来[16-17]。

2001年Sasaki等[7]通过表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)和cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)等方法发现MAGE-D4 mRNA存在MAGE-D4a、MAGE-D4b和MAGE-D4c等3种剪接变体，随后又采用RT-PCR法检测了胶质瘤、肺癌、胃癌、结肠癌和肝癌中MAGE-D4剪接变体的表达，结果显示剪接变体在所检测的胶质瘤中以MAGE-D4ab+c形式存在，其中MAGE-D4ab表达丰富；而其在所检测的其他肿瘤中以MAGE-D4c存在，且均有表达，提示MAGE-D4ab表达具有胶质瘤特异性而MAGE-D4c表达则具有肿瘤广泛性。

引物特异性是保证RT-PCR实验结果真实准确的关键因素，以上Sasaki等研究所用引物有其可取和不足之处，可取之处在于其以位于MAGE-D4开放阅读框(open reading frame，ORF)内的外显子3剪接区作为目的扩增片段(外显子2和12的剪接区位于非翻译区)，因为只有发生在ORF内的选择性剪接才会真正影响到基因翻译的产物；不足之处在于该对引物位于外显子内，没有跨任何内含子，使用该对引物进行PCR时，如果样品中有DNA污染可造成MAGE-D4c假阳性结果。因此本研究重新设计的引物仍然以外显子3剪接区作为目的扩增片段，但引物位置横跨3、4和5内含子，另外新设计的引物从两个方面验证了其特异性：一为分别以DNA和cDNA为模板进行扩增实验；二为对PCR产物进行测序比对。

本研究首先用新引物检测了胶质瘤中MAGE-D4剪接变体的表达，同时以非肿瘤脑组织作为对照，这也是首次进行的脑组织中MAGE-D4剪接变体表达检测。检测结果显示胶质瘤和脑组织中均存在MAGE-D4ab-c和MAGE-D4ab+c两种剪接变体形式，该结果与Sasaki等[7]的报道不一致，造成不一致的原因可能是两研究所用引物不同以及样品例数差异；结果还显示MAGE-D4ab及其MAGE-D4ab-c形式在胶质瘤中的表达率明显高于非肿瘤脑组织，而MAGE-D4c(MAGE-D4ab+c)差异无统计学意义，提示MAGE-D4ab中MAGE-D4ab-c形式与胶质瘤的发生有关；我们的结果还显示胶质瘤中MAGE-D4ab的表达明显强于MAGE-D4c，这和Sasaki等[7]的报道相一致。综上所述，胶质瘤中存在异常的MAGE-D4剪接变体表达，而这种异常可能是由外显子(或内含子)剪接增强子等顺式作用元件突变或SR、hnRNP蛋白等反式作用因子异构等因素引起的。

本研究还首次分析了MAGE-D4剪接变体在胶质瘤表达的临床意义，虽然MAGE-D4ab、MAGE-D4c、MAGE-D4ab-c和MAGE-D4ab+c分别与胶质瘤一些临床病理参数无相关性，但并不能以此完全否定其在胶质瘤诊断中的价值，原因有二：一是我们收集的临床资料不够全面，尤其是缺少生存资料；二是本研究只分析了MAGE-D4ab和MAGE-D4c表达的临床意义，缺少MAGE-D4a和MAGE-D4b分别表达的临床意义。

综上所述，本研究主要检测了MAGE-D4ab和MAGE-D4c剪接变体在胶质瘤的表达，并不是对以上Sasaki等实验的简单重复，而是针对其实验的不足，对其研究内容进行的完善和补充，本研究更能客观反映MAGE-D4剪接变体在胶质瘤的表达情况。当然，本研究也存在一些不足，如没有区分MAGE-D4a和MAGE-D4b，虽然MAGE-D4a和MAGE-D4b mRNA序列只相差12 bp，蛋白质序列也只有2个氨基酸的差异，但并没有证据显示二者的功能相同，因此有必要区分二者在胶质瘤表达中的差异；再如没有从蛋白水平检测MAGE-D4ab，我们虽然证实了MAGE-D4ab mRNA在胶质瘤中异常表达，但蛋白表达水平不一定与mRNA表达水平一致，因此有必要检测MAGE-D4ab蛋白；此外，MAGE-D4ab是否与MAGE-D4抗体产生有关以及在胶质瘤发生发展中其扮演什么角色等，目前也并不清楚。在今后的研究中，我们将针对这些问题深入探讨MAGE-D4剪接体和胶质瘤的关系，为将MAGE-D4应用于胶质瘤诊断和治疗奠定基础。