MicroRNA-217通过调控PGC-1α影响乳腺癌细胞增殖*

张韶辉，刘剑敏，胡 松

武汉市第一医院药学部，武汉 430022

乳腺癌的发病率近十年在全球呈上升趋势[1-2]。在发展中国家，乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因之一[3]。对于早期乳腺癌会采用手术、化疗、放疗等治疗手段，乳腺癌患者的平均生存率正在逐渐提高，但仍然有30%～40%的乳腺癌会发生转移[4]。

PPARγ共激活剂1α(PGC-1α)属于转录辅激活因子(PPARg coactivators，PGC)家族，在调节线粒体生物合成和能量代谢中发挥关键作用[5]。研究证实，PGC-1α不仅在乳腺癌中表达下调，而且可能作为肿瘤抑制因子发挥作用[6-7]。microRNAs(miRNAs)是一组进化保守的非编码小RNA，其功能是通过结合位于靶基因3′非翻译区(3′UTR)的互补DNA序列来抑制下游靶基因的表达。miRNA已被证明在人类乳腺癌的发生、细胞增殖、细胞周期进展和转移等过程的调控中起关键作用[8]。此外，miRNAs诱导了乳腺癌中的各种下游信号通路，如p27 Kip1和NF-κB[9-10]。近期研究证实，microRNA-217(miR-217)在乳腺癌中高表达，并且miR-217的表达抑制对乳腺癌细胞的增殖和细胞周期进程具有显著的抑制作用[11]。

为探明乳腺癌细胞中miR-217与PGC-1α可能的相互作用与调控关系，本研究首次采用双荧光素酶活性测定法检测miR-217与PGC-1α基因的作用。并以下调miR-217表达的乳腺癌细胞系为对象，检测miR-217对PGC-1α基因和蛋白表达的影响。进一步通过siRNA敲低miR-217表达下调的乳腺癌细胞中的PGC-1α，探讨miR-217靶向调节PGC-1α对乳腺癌细胞增殖和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳腺癌细胞系MCF-7来源于武汉中科院细胞库，DMEM培养液和胎牛血清、miR-217-mimics及阴性对照(miR-mc)、RNA提取试剂盒及反转录试剂盒、MTT试剂盒均购自ThermoFisher Scientific公司，miR-217抑制物及阴性对照购自广州Ribobio公司。双荧光素酶报告试剂盒购自Promega公司，实时定量PCR试剂盒购自Apple BioSosits公司，PGC-1α抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。Si-PGC-1α、Si-DACH1及其阴性对照siRNA(Si-C)购自GE DeMaCon。

1.2 生物信息学分析

使用在线miRNA靶标预测工具TargetScan(www.targetscan.org)对靶向结合PGC-1α 3′UTR的miRNA进行预测。

1.3 双荧光素酶活性测定

将PGC-1α基因的3′UTR插入到psi-CHECK-2质粒海肾荧光素酶基因中，构建psi-CHECK-PGC-1α-3′UTR质粒。将PGC-1α 3′UTR区突变，并插入psi-CHECK-2质粒中，产生突变psi-CHECK-PGC-1α-mut-3′UTR质粒。在体外培养人HEK-293T细胞中，将miR-217-mimics与PGC-1α-3′UTR或PGC-1α-mut-3′UTR共转染48 h。比较共转染HEK-293T细胞的相对荧光素酶活性。

1.4 细胞培养及转染

MCF-7细胞用含10%FBS的DMEM培养液，置于5%CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养，收集对数生长期的细胞接种于6孔板上。按照转染试剂盒说明书，将miR-217抑制物(miR-217-inhibitor)或阴性对照miR-IC及6 μg/mL polybrene与细胞共孵育。转染72 h之后更换新鲜培养液并传代1～2周以稳定转染效果。实时荧光定量聚合酶链反应检测转染效率。

1.5 RNA提取及实时荧光定量聚合酶链反应

使用Trizol提取总RNA，提取后使用NanoDro ND-1100分光光度计检测样品的浓度与纯度。miR-217测定采用TaqMan microRNA检测试剂盒，PGC-1α测定采用SyBR qRT-PCR检测试剂盒，以sonRNU202作为内参照。反应条件为95℃ 2 min；95℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，循环40次。PCR扩增产物检测采用ABI7900 Real-time PCR system进行，结果以2-ΔΔCt进行定量分析。

1.6 Western blot法检测蛋白质表达

将蛋白提取缓冲液加入到转染后的MCF-7细胞中，收集其细胞裂解液并测定蛋白浓度。将30 mg稀释的蛋白质加样到0.8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，再电转移到PVDF膜上。在室温下，用5%的脱脂牛奶在TBST缓冲液中封闭1 h后，分别加入PGC-1α(1∶100)和DACH1(1∶500)一抗，4℃孵育过夜。清洗3次(TBST，每次10 min)后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)室温孵育2 h，TBST清洗2次后加入免疫印迹化学发光试剂进行放射自显影。

1.7 siRNA转染下调PGC-1α及DACH1

将4×104～5×104个细胞接种在培养板上，根据试剂说明书使用Dharma FECT siRNA转染试剂对细胞进行PGC-1α siRNA及DACH1 siRNA转染。ON-TARGET plus Non-targeting siRAN作为阴性对照进行转染，24 h之后用qRT-PCR法验证转染效率。

1.8 MTT法检测细胞增殖

将对数生长期MCF-7细胞接种于96孔板中(5×103细胞/孔)，置于37 ℃含5%CO2的培养箱中培养5 d。然后使用Vybrant MTT细胞增殖测定法(ThermoFisher Scientific，USA)检测590 nm的吸光度值(A590 nm)，以此代表细胞增殖活力。

1.9 流式细胞术检测细胞周期

MCF-7细胞在4℃下用70%的乙醇固定1 h，用200～500 μL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，加入RNase A溶液20 μL，37 ℃水浴30 min后用50 μg/mL碘化丙啶避光染色1 h，使用Fascalibur流式细胞仪测量。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 PGC-1α上游miRNA调节因子预测

使用microRNA靶基因预测软件TargetScan(www.targetscan.org)寻找PGC-1α上游可能的miRNA调节因子。候选miRNA的标准是Context++得分大于90%。基于此，找到了10个miRNA候选基因[12-26](表1)。由于PGC-1α在乳腺癌中低表达，因此需要寻找在癌组织中高表达，且有研究提示其在乳腺癌发生发展中具有致癌作用的miRNA。最终筛选发现，miR-217很可能是PGC-1α的候选上游调节因子，因为miR-17在乳腺癌中被证实上调，miR-217的抑制对乳腺癌细胞系MDA-MB-231[26]的增殖和细胞周期进展有抑制作用。

表1 PGC-1α可能的上游miRNA调节因子Table 1 Predicted upstream miRNA regulators of PGC-1α

2.2 PGC-1α是miR-217的靶基因

通过Targetscan预测发现，miR-217与PGC-1α的3′UTR存在结合位点(图1A)。因此，PGC-1α可能是miR-217的靶基因。双荧光素酶活性测定发现，miR-217-mimics组的相对荧光素酶活性较对照组显著下降(图1B，P<0.05)，表明miR-217与PGC-1α基因的野生型3′UTR结合，可抑制下游的荧光素酶表达，而对突变型PGC-1α-3′UTR区的启动无影响。为进一步确认PGC-1α是miR-217的靶基因，利用miR-217-inhibitor抑制MCF-7细胞中内源性miR-217表达，qRT-PCR分析显示miR-217-inhibitor组比miR-IC组表达水平明显降低，差异有统计学意义(图1C，P<0.05)，表明转染成功。进一步qRT-PCR检测显示，转染miR-217-inhibitor的MCF-7细胞PGC-1α mRNA表达水平明显上升(图1D，P<0.05)。Western blot分析也表明，miR-217-inhibitor转染细胞PGC-1α的蛋白表达水平显著上调(图1E)。

A：miR-217与PGC-1α的可能结合位点；B：双荧光素酶活性测定；C：qRT-PCR验证miR-217-inhibitor转染效率；D：qRT-PCR检测miR-217表达下调对PGC-1α基因表达的影响；E：Western blot检测miR-217表达下调对PGC-1α蛋白表达的影响；*P<0.05图1 PGC-1α是miR-217的靶基因Fig.1 miR-217 is the upstream regulator of PGC-1α

2.3 miR-217通过调控PGC-1α基因影响MCF-7细胞的增殖

已有研究证实下调miR-217抑制了乳腺癌细胞的增殖、导致了细胞周期的阻滞[11]。为进一步证明miR-217通过调控PGC-1α基因表达发挥上述作用，通过siRNA(Si-PGC-1α)转染下调PGC-1α表达并设置相应对照(Si-C)。qRT-PCR显示，PGC-1α的mRNA水平在Si-PGC-1α转染后被显著抑制(图2A，P<0.05)。Western blot分析亦证实，PGC-1α蛋白表达被下调(图2B)。MTT增殖实验结果表明，在miR-217表达下调的乳腺癌细胞中，抑制PGC-1α能显著促进细胞增殖(图2C，P<0.05)。此外，流式细胞术分析显示，在miR-217表达下调的乳腺癌细胞中，PGC-1α抑制也显著促进了细胞周期从G0/G1期向S期的转变(图2D)。

A：qRT-PCR验证siRNA转染效率，*P<0.05；B：Western blot验证siRNA转染效率；C：MTT增殖实验检测PGC-1α表达抑制对细胞增殖的影响,与miR-217-inhibitor/Si-C组比较，*P<0.05；D：流式细胞术检测PGC-1α表达抑制对细胞周期的影响图2 miR-217通过调控PGC-1α基因影响MCF-7细胞的增殖Fig.2 Inhibition of PGC-1α reverses miR-217-downregulation induced suppression on MCF-7

2.4 miR-217对乳腺癌细胞PGC-1α的调节作用独立于DACH1

有研究提示miR-217可通过靶向调控DACH1促进乳腺癌细胞增殖[11]。因此，我们进一步探寻了PGC-1α和DACH1是否在miR-217表达下调的乳腺癌中具有功能性相互作用。在PGC-1α/DACH1 siRNA联合转染的MCF-7细胞中进行了5 d的MTT增殖试验。结果表明，下调PGC-1α表达后，即使抑制DACH1表达也能进一步促进乳腺癌的增殖(图3A，P<0.05)。此外，流式细胞术分析显示，在miR-217下调及PGC-1α抑制的乳腺癌细胞中，即使抑制DACH1表达也能促进细胞周期从G0/G1期到S期的转变(图3B)。

上述研究表明PGC-1α和DACH1的信号通路在miR-217下调的乳腺癌细胞中是独立的。

A：MTT增殖实验检测PGC-1α及DACH1表达均抑制后对细胞增殖的影响，与miR-217-inhibitor/Si-PGC-1α/Si-C组比较，*P<0.05；B：流式细胞术检测PGC-1α及DACH1表达均抑制后对细胞周期的影响图3 miR-217对乳腺癌细胞PGC-1α的调节作用独立于DACH1Fig.3 PGC-1α regulation in miR-217-dwonregulated breast cancer is independent of DACH1

3 讨论

在人类乳腺癌中，虽然发现PGC-1α在癌组织中的表达与在正常乳腺上皮组织中的表达存在差异[6-7]，但未证实它对乳腺癌有直接调节作用[27]。本研究在人类乳腺癌中寻找与PGC-1α相关的miRNA上游调控因子。用TargetScan靶基因预测软件发现了10个miRNA候选基因，基于miR-217与PGC-1α的结合Context++ 得分为90%，且miR-217有促进乳腺癌细胞增殖和细胞周期进展的作用[11]，我们推测miR-217可能是乳腺癌中PGC-1α的上游调节因子。

本研究结果证实了miR-217是人类乳腺癌PGC-1α上游调节因子的假设。首先，共转染双荧光素酶活性检测表明，人miR-217确实与PGC-1α基因的3′UTR结合。其次，在下调miR-217表达的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中，PGC-1α mRNA和蛋白水平均显著上调。最重要的是，在miR-217表达下调的乳腺癌细胞中，抑制PGC-1α表达能显著促进癌细胞增殖及细胞周期进程，这是在乳腺癌体外研究中关于PGC-1α调控的一个新发现，此前未见有研究报道PGC-1α在乳腺癌调控中的直接作用。正如我们在这项研究中所揭示的，PGC-1α的一般表达水平似乎对触发乳腺癌的体外调节因素及生物学功能无效，然而，在miR-217下调诱导的基础上，抑制PGC-1α表达可能具有致癌作用。

已有研究证明DACH1是miR-217的下游靶基因，其高表达可逆转miR-217诱导的乳腺癌进展。因此，我们进一步在miR-217表达下调的乳腺癌细胞中进行了PGC-1α和DACH1靶向siRNA的双重转染，发现下调PGC-1α表达后，即使抑制DACH1表达也能进一步促进乳腺癌细胞的增殖，提示PGC-1α和DACH1的调控信号通路是相互独立的。本研究仅在体外实验水平进行探究，进一步的体内实验室研究，包括对PGC-1α和DACH1下游信号通路的探索，必将有助于阐明乳腺癌中miRNA的复杂调控网络。