气相色谱氢火焰离子法测定三文鱼中氨基酸的含量

师子豪，祝伟霞＊，魏 蔚，杨冀州，赵运胜

（郑州海关技术中心，郑州 450003）

三文鱼属于冷水性高度洄游鱼类，是鲑科鱼类或鲑鳟鱼类的商品名称，是世界名贵鱼类之一。三文鱼鳞小刺少，肉质细嫩鲜美，在众多的海产品中，以其独特的口味、丰富的营养，受到越来越多人的青睐。氨基酸是三文鱼体内蛋白质的基本分子，参与机体维持、蛋白质周转、生物代谢等重要生命活动。近年来，在食品科学、环境工程、生物化学等领域有关氨基酸的分析已成为热点问题[1]。我国是三文鱼的主要进口国家，为准确评价三文鱼的营养品质，保障进口食品的质量安全，建立三文鱼中氨基酸含量的分析方法是非常重要的。

目前，氨基酸检测的研究报道主要采用氨基酸分析仪[2]、液相色谱法[3]、离子色谱法[4]、气相色谱-氢火焰离子化法（GC-FID）[5]、气相色谱质谱（GCMS）[6]、液相色谱质谱（LC-MS）[7]、气相色谱-同位素比值质谱（GC-IRMS）[8][9]等技术。为将氨基酸结构中羧基和氨基极性基团生成相应的挥发物，本文联合采用分步衍生化进行操作，首先在酸化甲醇进行醇基甲酯化，再在碱性乙酸酐溶剂中进行氨基乙酰化衍生反应，衍生物经GC-FID进行测定。测定结果经与国家标准GB5009.124-2016[10]进行比较，证明本方法结果准确，可用三文鱼中氨基酸的含量测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GC2030型气相色谱仪-氢火焰离子化检测器（日本岛津公司）；T18型涡旋混匀器（德国IKA公司）；OA-SYS氮气浓缩仪（美国Organomation公司）；16种氨基酸标准品，纯度≥95%，均购于美国Sigma-Aldrich公司；乙酸酐（色谱纯，天津富宇试剂）；甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，德国默克公司）；乙酰氯（色谱纯，上海阿拉丁公司），其它均为国产分析纯试剂。

氨基酸标准溶液制备：称取氨基酸标准物质250mg于25mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容，配制成质量浓度为10mg/mL的单个氨基酸标准溶液。准确量取2mL的单标溶液用0.1mol/L盐酸溶液稀释并定容50mL，配制得到质量浓度为400mg/L的氨基酸混合标准溶液。

1.2 试验方法

称取10mg干基样品，加入2mL6mol/L盐酸溶液，涡旋混匀3min，氮气置换上层空气，110℃烘箱24 h水解，取出后降至室温，加入正己烷-二氯甲烷（6:5）液液分配除脂，并于70℃氮气流下吹干。加入甲醇-乙酰氯（6:1,V/V）0.7mL，涡旋混匀1min，70℃反应1h，取出后冷却至室温，氮气吹干。再加入乙酰化试剂乙酸酐-三乙胺-丙酮（1:2:5,V/V/V）于70℃反应10min后，氮气吹干。加入2mL乙酸乙酯溶解残渣，1mL饱和氯化钠液液分配，于4000r/min离心后取上层有机相，无水硫酸钠除水，经0.22 有机相膜过滤，供GC-FID检测。

1.3 仪器工作条件

美国安捷伦VF-35ms色谱柱（30m×0.32mm，1.0μm）；进样口温度为300℃，检测器温度为305℃；氢气流量和空气流量分别为32mL/min和350mL/min；载气为氦气，载气流量为5.06mL/min；不分流进样；进样量为1μL。色谱柱升温程序：80℃保持1min，再以20℃/min的速率升至135℃，再以3℃/min的速率升至180℃，再 以5℃/min的 速 率 升 至220℃，再 以15℃/min的速率升至305℃并保持10min，总运行时间为42.42min。

2 结果与讨论

2.1 甲基化反应条件的优化

氨基酸结构中含有氨基和羧基极性结构，进行测定时需采用相应的衍生化技术，生成适合气相色谱分析的挥发性物。因为氨基酸分子中的羧基与其它有机酸的羧基一样，在酸性条件下可以与小分子醇反应生成相应的酯类物质。本文首先比较了甲醇、乙醇、异丙醇进行甲酯化的效果，结果证明采用甲醇反应产率高。通过对不同比例甲醇-乙酰氯（1:3、1:6、1:9，V/V）溶剂进行试验，数据表明甲醇-乙酰氯（1:6，V/V）时，色氨酸响应最高（如图1所示），其它19种氨基酸甲酯化产物≥92%。本方法最终采用甲醇-乙酰氯（1:6，V/V）进行甲酯化。

图1 甲醇-乙酰氯衍生化条件下，色氨酸色谱峰的响应。（A为1:3，B为1:6，C为1:9）

2.2 乙酰化反应条件的优化

反应温度和反应时间作为乙酰化衍生化的重要因素，本文对比了在10min～120min时间和在20℃～100℃温度之间的区别。结果表明70℃水浴反应10min乙酰化效率最高。图2列出16种氨基GC-FID色谱图。

图216 种氨基酸标准溶液GC-FID色谱图

2.3 标准曲线、检出限及回收试验

取氨基酸标准溶液按照本方法所述操作进行衍生化，分别在200mg/L，100mg/L，50mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L浓度水平进行测定，线性方程和相关系数见表1。在三文鱼样品中添加质量浓度50mg/kg的标准物质，测得回收率见表1。

表1 回归方程线性、R2值、三文鱼样品中添加浓度及其回收率

续表

3 实际样品的测定

采用本方法测定三文鱼样品，测定样品图谱见图3，测定结果经与国家标准GB5009.124-2016比较，两种方法测定结果一致，结果偏差小于10%，本方法可用于三文鱼中氨基酸含量的测定。

图3 挪威三文鱼样品中16种氨基酸GC-FID色谱图