高糖高脂饲料对草鱼TNF-α和TRAF1/TRAF2mRNA表达的影响

林梦君，贾申宗，余维鹏，张文雅，卢荣华＊

（河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国淡水养殖产量最大的经济鱼类，具有生长速度快、肉质鲜美等优点，深受消费者的喜爱。但在集约化养殖过程中，饲料中脂肪和碳水化合物含量过高，营养组成不平衡，导致草鱼体内能量代谢平衡被打破[1]，经常出现脂肪异位蓄积、抗应激能力下降等问题。因此，如何提高草鱼对糖脂的利用能力、改善体内脂质蓄积以及提高鱼体免疫力已显得非常迫切。

肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor α,TNFα）是一种细胞因子。研究发现，TNF-α可以结合其受体（TNFR），通过招募肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAFS）家族分子（如TRAF1、TRAF2）调节细胞的增殖、凋亡、免疫应答和炎症反应，进而调控机体的许多生物过程[2]。在青石斑鱼（Epinephelus awoara）、金鲳鱼（Trachinotus ovatus）的研究中发现，过表达TRAF2可促进神经坏死病毒（RGNNV）的复制过程[3]。对草鱼的研究发现，在草鱼头肾中TNF-α可上调TRAF1和TRAF2的 表 达[4]，说 明TNF-α、TRAF1和TRAF2在机体免疫中发挥重要作用。

本研究采用高糖高脂饲料饲喂草鱼，饲养实验结束后检测草鱼肝脏、肌肉和脂肪组织中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表达变化，研究结果可为进一步探讨三种基因在草鱼脂肪蓄积及营养调控中的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RNA提取试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司（大连），本实验引物合成由Invitrogen基因公司提供。

1.2 高糖高脂饲料对草鱼肝脏组织脂肪蓄积的影响

选取平均初始体重39.98 ±0.84g的草鱼180尾，随机分为2组：对照组和高糖高脂饲料组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，实验饲料配方及营养组成与本课题组已发表的文献一致[5]。在河南师范大学水产学院循环水养殖系统中暂养两周，养殖桶容量为200L，水温23～26℃，溶解氧5.0mg/L以上，水交换量1L/min，氨基氮＜0.01mg/L，光照周期为12L:12D。在正式实验前，先将草鱼用对照组饲料驯化一周，每天8:30、13:00和17:30饲喂3次，正式养殖65d。养殖实验结束后，每桶取6尾鱼的肝脏于4%多聚甲醛中固定、石蜡包埋、切片、HE染色、封片、电子显微镜下观察肝脏组织病理变化。

1.3 高糖高脂饲料对草鱼TNF-α、TRAF1及TRAF2基因表达的影响

养殖实验结束后，每桶取3尾草鱼，将草鱼麻醉后立即于无菌条件下解剖分离脂肪、肝脏和肌肉组织，液氮速冻后-80℃保存备用。使用qRT-PCR技术，检 测 脂 肪、肝 脏 和 肌 肉 中TNF-α、TRAF1和TRAF2的相对表达量。

1.4 实时荧光定量PCR

表1 实时荧光定量引物序列

1.5 统计分析

采用SPSS20.0 统计分析软件对数据进行独立样本T检验分析。不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 草鱼肝脏组织HE染色

由图1可见，与对照组（图1A）相比，高糖高脂饲料组的草鱼肝脏细胞空泡化严重，细胞核明显移位，且出现大量大的脂滴（图1B）。

图1 高糖高脂饲料饲喂对草鱼肝脏组织脂肪蓄积的影响（HE，×100）

2.2 高糖高脂饲料对草鱼TNF-α、TRAF1和TRAF2基因表达的影响

采 用qRT-PCR技 术 检 测TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在肝脏、脂肪和肌肉组织中的表达量（图2，图3，图4）。结果显示，与对照组相比，高糖高脂饲料可以显著降低草鱼肌肉组织中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表达（P＜0.05），但三个基因在脂肪组织中均显著升高（P＜0.05），在肝脏组织中仅TRAF1的表达量显著升高（P＜0.05），TNF-α和TRAF2的表达量均无显著性变化（P＞0.05）。

图2 TNF-α在草鱼不同组织中的表达

图3 TRAF1在草鱼不同组织中的表达

图4 TRAF2在草鱼不同组织中的表达

3 讨论

本研究中，从肝脏组织学形态结果来看，高糖高脂组的草鱼肝细胞中脂滴明显增多，甚至出现了炎性细胞浸润，这与斑马鱼[7]中的研究结果类似。

众所周知，脂肪组织可以分泌多种细胞因子，TNF-α就是脂肪组织产生的一种多效应细胞因子。在本研究中，与对照组相比，高糖高脂可诱导草鱼脂肪组织中TNF-α、TRAF1及TRAF2的表达增加，说明TNF-α、TRAF1和TRAF2可在脂肪组织中表达并分泌，导致脂肪组织炎症的发生，并可能引起胰岛素抵抗，进而诱发多种代谢性疾病[8]。姜志浩等[9]研究发现，与正常日粮相比，高脂日粮饲喂的大鼠脂肪组织中TNF-α基因mRNA表达水平均显著上调，诱导脂肪组织中炎症的发生，与本研究结果一致。

肝脏是鱼类糖脂代谢的重要器官，对鱼体内糖脂代谢的平衡至关重要。本研究中发现高糖高脂饲料可引起草鱼肝脏中TRAF1的含量显著升高且肝脏脂肪过量蓄积，唐祝奇[10]研究也发现，TRAF1在胰岛素抵抗的小鼠肝脏组织中明显升高，敲低TRAF1的表达后可减轻高脂诱导的细胞内脂质蓄积。Chen等[11]发现在高脂条件下，肝细胞特异性缺失TRAF2不会改变肝脏炎症和胰岛素信号转导，但可减轻饮食诱导的高血糖，本实验也发现高糖高脂饲料饲喂后肝脏中TRAF2的表达未发生变化，提示我们可能是TRAF1而不是TRAF2在肝脏中发挥重要的营养调节作用。周嫚[12]研究发现，高脂饲喂可导致团头鲂肝脏中脂肪含量增加，TNF-α表达量显著增加，推测TNFα可能通过调节脂质合成和脂肪酸的β氧化来参与调控机体脂质代谢稳态。本研究显示高糖高脂并没有引起肝脏中TNF-α和TRAF2的含量发生变化，可能原因是在草鱼肝脏组织中，是TRAF1作为炎症通路的主要转导蛋白通过靶向某一信号转导因子进而导致肝脏脂肪变性和炎症发生，但具体机制需要进一步研究验证。

本研究也检测了草鱼肌肉组织中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表达变化，发现高糖高脂组这三个基因的表达均显著低于对照组，这可能是因为脂肪细胞是分泌TNF-α的主要组织，TNF-α可以直接作用于脂肪组织，而TNF-α可能通过作用于脂肪细胞后产生的某些物质间接作用于肌肉组织，以发挥不同的功能，具体作用机制仍需要深入研究。

4 结论

本实验发现高糖高脂饲料可引起草鱼肝脏脂肪过度蓄积，且对草鱼TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在不同组织中的mRNA表达水平影响不同，而这些组织也是鱼类脂肪沉积及能量代谢的主要部位，提示TNF-α、TRAF1与TRAF2可能在高糖高脂诱导的脂肪沉积和炎症中发挥不同的作用，这为进一步探讨这三个基因对高能物质的响应机制提供了一定的理论基础。