金线莲醇提物和水提物生物活性研究

陈健敏 刘思弯 冉梦楠 王美霞 刘欣莹

1.莆田学院 药学与医学技术学院，福建 莆田 351100；2.药物分析与检验医学福建省高校重点实验室，福建 莆田351100

0 前言

金线莲(Anoectochilus roxburghii)属于兰科(Orchidaceae)开唇兰属草本植物，主要分布在我国南方地区，如福建、浙江、广东、广西和台湾等省[1]。它是一种传统的珍贵中草药，具有清热凉血、祛风利湿等功效[2]。现代药理试验研究表明，它在治疗肝病、糖尿病、肿瘤、高脂血症、痛风性关节炎、类风湿性关节炎和关节炎等疾病中表现出一定的药理活性[3]，可能是因为其富含黄酮类、酚类、多糖类和内酯苷类等物质[4]。如何有效提取这些活性成分，充分发挥金线莲的药效，是金线莲相关产品开发的关键。目前，文献对有机溶剂提取黄酮类成分或采用水为溶剂提取多糖类成分进行生物活性研究，而对醇提物和水提物中成分含量及活性的差异的比较研究较少。然而，通过比较研究醇提物或水提物中成分和活性的差异，对于金线莲资源的利用十分重要。因此，本研究分别以乙醇和水作为溶剂，制备金线莲的醇提物和水提物，比较两种提取物中总黄酮和总酚的含量差异，并对两种提取物的抗氧化能力、酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性进行研究。研究结果表明，醇提物中的总黄酮和总酚含量均高于水提物，在抗氧化能力和酪氨酸酶抑制方面醇提物都具有更强的活性。值得注意的是，本研究为金线莲相关产品的研究开发提供了理论支持。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

BSM 分析天平，上海卓精科技有限公司；UV-2500 紫外可见分光光度计，日本津岛；HH-4 数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；Milli-QPlus 超纯水发生器，德国赛多利斯；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵，郑州特尔仪器设备有限公司；RE-52 型旋转蒸发仪，上海央申科技仪器公司。

1.2 实验材料

金线莲干植株由福建省莆田市仙游县白洋村金线莲基地赠予。酪氨酸酶(来源于蘑菇，批号：J417049，比活力为500 U/mg)、抗坏血酸(批号：MB4168)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(批号：M07334)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(批号：L1619007)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)(批号：I1721068)、无水乙醇(批号：J20202254)、黄嘌呤氧化酶(来源于硫酸铵悬浮液，批号：SLBW8163)比活力为0.5 U/mg)、左旋多巴(批号：J1417049)、L-酪氨酸(批号：H1408317)、三氯化铁(Ⅲ)六水合物(批号：C1709031)、单宁酸(批号：F1705100)、磷钼酸(批号：R21257)、钨酸钠二水合物(批号：F1715066)、磷酸(批号：D150808)、没食子酸(批号：F1719036)、福林酚试剂(批号：HF201910327)和芦丁三水合物(批号：K1618018)均购自上海晶纯生化科技股份有限公司。

2 方法

2.1 金线莲提取物的制备

金线莲醇提物和水提物的制备采用参考文献中的方法[5-6]，并做一些调整。醇提物的制备：将金线莲干植株粉碎，过3 号筛，称取干燥恒重的金线莲粉末20 g，按料液比1 g ∶10 mL 加入体积分数为80%的乙醇浸泡，将沉淀物重复浸泡3 次，每次24 h，3次的浸出液合并，水浴温度设为45 ℃，通过旋蒸浓缩至50 mL 后，取出浓缩液于60 ℃真空干燥箱烘干，收集研磨成粉末状即得金线莲醇提物。水提物的制备：将金线莲干植株粉碎，过3 号筛，称取干燥恒重的金线莲粉末20 g，按料液比1 g ∶10 mL 加入蒸馏水浸泡，放置过夜，于80 ℃水浴中回流3 次，每次1 h，过滤，合并各次滤液，旋转蒸发成浸膏，取出后于60 ℃真空干燥箱干燥24 h，即得金线莲水提物。产率采用提取物的重量除以金线莲粉末的重量(20 g)来计算。

2.2 金线莲提取物中总黄酮的含量测定

在碱性溶液中，黄酮分子结构中的A 环上3 位和5 位羟基以及B 环上的邻苯二羟基与三价铝离子会显色[7]，因此可用三氯化铝显色法测定金线莲提取物中总黄酮的含量。分别取不同浓度的芦丁对照物质溶液或提取物溶液100 μL 于10 mL 容量瓶中，先加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，室温下放置6 min 后，加入0.4 mL 10%三氯化铝溶液，室温下放置6 min 后，加入3.2 mL 氢氧化钠溶液，用体积分数为80%乙醇溶液定容至刻度，室温下放置10 min，在505 nm 处测定其吸光度A1；取芦丁对照物质溶液或提取物100 μL 于10 mL 容量瓶中，以体积分数为80%乙醇溶液定容至刻度，在505 nm 处测定其吸光度A2；根据制备A1样品的步骤，不加芦丁对照物质溶液或提取物，其他条件不变，测定其吸光度A3。最终得到扣除背景的吸光度A＝A1-A2-A3。以芦丁样品的吸光度A 为纵坐标，相应浓度为横坐标，计算得到总黄酮含量测定的回归方程：Y＝0.010 6X＋0.050 4(R2＝0.991 5)，结果表明，芦丁在24～128 μg/mL 范围内线性良好。以金线莲提取物样品测得的吸光度带入方程计算，可得提取物中总黄酮的含量。

2.3 金线莲提取物中总酚的含量测定

在碱性条件下，多酚类物质可以把福林-肖卡试剂中的磷钨酸和钼酸还原，生成蓝色混合物，在一定范围内，其吸光度与总酚含量呈线性关系[8]，因此可用福林-肖卡试剂测试金线莲提取物中的总酚含量[9]。以没食子酸为对照物质，其标准曲线的绘制方法如下：吸取0、5、10、20、30 和50 mg/L 没食子酸标准溶液0.5 mL 分别置于10 mL 试管中，分别加入1.0 mol/L 的福林酚试剂0.73 mL，在1 min 内加入30.00 g/L 的碳酸钠溶液4 mL，45 ℃水浴中避光显色112.0 min，于765 nm 处测定溶液吸光度，以测定的吸光度为纵坐标，以相应浓度为横坐标，得到线性回归方程，Y＝0.141 2X-0.006 9(R2＝0.998 1)。提取物的测定：取0.5 mL 提取物溶液(1.25 mg/mL，预实验结果得出)，采用标准曲线中的测定方法测定，每个样品进行3 次平行实验(n＝3)，将吸光度代入回归方程，可计算出提取物相应的没食子酸含量。

2.4 金线莲提取物的抗氧化能力测试

以抗坏血酸作为对照物质，采用ABTS、DPPH 和FRAP 三种方法测定金线莲提取物的抗氧化能力。ABTS 与过硫酸钾溶液混合后形成蓝色的ABTS＋阳离子自由基，在抗氧化剂存在时，自由基被清除而导致溶液退色，利用该原理可以测定物质的抗氧化能力。将不同浓度的提取物溶液与2 mL ABTS＋工作液(混合前0 min 测定734 nm 吸光度A0)混合，10 min 后在734 nm测定吸光度值A10，可计算自由基清除率(%)＝[(A10-A0)/A0]×100%[10]。DPPH 自由基有单电子，在517 nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色；抗氧化剂会与单电子配对而使DPPH在517 nm 吸收消失，其褪色程度与其自由基清除能力和浓度呈正相关，可利用此原理测定物质的抗氧化能力。分别将不同浓度的100 μL提取物溶液及2 mL DPPH 溶液(0.1 mmol/L)加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30 min 后测定其吸光度A1，同时测定100 μL 溶剂与2 mL DPPH 溶液混合后的吸光度A2，以及100 μL 测试样品溶液与2 mL 无水乙醇混合后的吸光度A3。在517 nm 处读取吸光度后，可计算清除率＝[1-(A1-A3)/A2)]×100%[11]。酸性条件下抗氧化剂可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3＋-TPTZ)产生蓝色的Fe2＋-TPTZ[12]，可以据此测试物质的抗氧化能力。取3.3 mL 的缓冲液，向其中加入330 μL的FeCl3溶液(20 mmol/L)，加入330 μL 的TPTZ 溶液(10 mmol/L)，混合均匀，在37 ℃恒温孵育5 min。再加入330 μL 的样品，在37 ℃恒温反应15 min 后，在波长为593 nm 处测定其吸光度值。与对照物质溶液比较，吸光度值高的抗氧化能力强。

2.5 酪氨酸酶活性抑制试验

在生物体内，酪氨酸酶能催化酪氨酸转化为多巴(单酚酶活性)，再将多巴氧化为多巴醌(双酚酶活性)，而多巴醌在475 nm 处有较强的吸收。因此，分别以酪氨酸和多巴作为底物，检测多巴醌形成的速率便可以测试样品溶液对酪氨酸酶活性的影响。测定酪氨酸酶单酚酶活性以0.5 mmol/L 酪氨酸为底物，测定酪氨酸酶双酚酶活性以0.5 mmol/L多巴为底物，均用0.05 mmol/L 磷酸缓冲溶液(pH ＝6.8)配制[13]。测定酪氨酸酶单酚酶活性时，在比色皿中，依次加入2.8 mL 酪氨酸、100 μL 不同浓度的待测样品溶液(曲酸和金线莲提取物)和100 μL 酪氨酸酶(1 000 U/mL)，加入酶后开始计时，测定30 min 内每分钟在475 nm 处的吸光度值；测定酪氨酸酶双酚酶活性时，取试管A1、A2和A3，分别加入2.8 mL 底物溶液，32 ℃预热10 min 后，A2和A3加入100 μL 待测样品溶液，A1加入等体积溶剂。混匀后，A1，A2加入100 μL 酪氨酸酶(400 U/mL)溶液，A3加入100 μL 相应的磷酸缓冲溶液，摇匀，反应10 min 后测定475 nm 处的吸光度值。根据公式，酶活性＝[(A2-A3)/A1]×100%，计算出相应样品溶液下的相对酶活性。

2.6 黄嘌呤氧化酶活性抑制试验

黄嘌呤氧化酶既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而催化黄嘌呤生成尿酸，又能直接催化黄嘌呤生成尿酸；通过抑制其活性能够降低血液中尿酸的浓度，从而治疗尿酸过高引起的痛风等疾病。因此，以黄嘌呤作为底物，通过黄嘌呤氧化酶抑制试验测试金线莲提取物是否能够抑制黄嘌呤氧化酶，是否具备治疗痛风的潜力[14]。取四支试管，标记为A1、A2、A3和A4，分别都加入2.7 mL 底物(0.1 mmol/L 黄嘌呤)溶液后，A2和A3加入100 μL 提取物溶液，A1和A4加入等体积DMSO。混匀后，A1，A2加入200 μL黄嘌呤氧化酶(0.04 U/mL)溶液，A3和A4加入200 μL 0.2 mol/L 磷酸缓冲溶液(pH＝7.58)，摇匀，反应10 min 后测定290 nm 处的吸光度值[15]。根据公式，酶活性(%)＝ [(A2-A3)/(A1-A4)]×100%，计算出相应样品下的酶活性。

2.7 数据统计分析

所有试验数据均重复3 次(n＝3)，采用Microsoft Office Excel 2007 数据分析工具进行处理，并用Duncan多重比较(SSR 法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P＜0.05)。试验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用Origin Pro 8.5 软件作图。

3 结果与讨论

3.1 金线莲提取物及产率

金线莲醇提物为棕褐色粉末，具有中药的芳香气味，产率为11.01%。本研究中醇提物的产率远高于文献报道的2.27%[16]，主要原因可能是提取工艺和乙醇浓度的差异，文献中是先采用水提取后再醇提，可能有一部分既可溶于水又可溶于醇的物质已在水提物中。金线莲水提物因其中含有较多糖分，无法完全干燥，表现为棕褐色半固体浸膏，同样具有中药的芳香气味，产率为17.31%。本研究所得的水提物产率大大低于文献报道的33%[17]，主要原因可能是投料量、提取温度和提取时间的差异导致。总之，影响提取物产率的因素较多，包括金线莲品种、溶剂浓度、提取温度、提取时间和料液比等，所得到的成分也有较大差异[18]。因此，在不同工艺条件下，比较金线莲醇提物和水提物的成分和药理活性差异，对金线莲的进一步开发利用十分重要。

3.2 金线莲提取物中总黄酮和总酚的含量

以芦丁为对照物质测定金线莲提取物的总黄酮含量，发现醇提物中含量为8.11 mg/g，水提物中含量低于方法检测限，无法测得；可能是因为黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，所以一般采用有机溶剂提取总黄酮。文献报道12 批金线莲总黄酮的含量在3.89～15.17 mg/g 的范围内[19]，本研究测得的总黄酮含量在此范围内。不同来源、批次的金线莲的总黄酮有一定的差异，可能与其生长年限和生长环境、提取工艺等因素有关[20-21]。以没食子酸作为对照物质测定金线莲提取物的总酚含量，结果发现醇提物中含量为4.19 mg/g，而水提物中含量为1.22 mg/g，表明大部分酚类物质仍是较易溶于有机溶剂中。金线莲醇提物和水提物中总酚含量具有较大差异，目前国内外未见报道。虽有文献[22]报道金线莲中的总酚含量为4.1 mg/g，但并未提到采用何种溶剂提取。可以看出，这一数值与本研究的醇提物结果非常一致。

3.3 金线莲提取物的抗氧化能力

采用ABTS、DPPH 和FRAP 三种常用的方法测试金线莲提取物的抗氧化能力，结果见图1。

图1 金线莲醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）的抗氧化能力测定

从图1A 可以看出，金线莲醇提物(Ethanol extracts)在各个不同的浓度下，其ABTS 自由基清除能力均显著高于水提物(Water extracts)，当二者浓度达到10 mg/mL 时，清除率分别为(62.00±4.36)%和(14.88±3.36)%，表明醇提物的抗氧化能力约为水提物的4.2 倍。DPPH 测试结果显示(图1B)，每个测试浓度点，醇提物的清除率同样显著高于水提物(P＜0.05)，分别为(68.69±5.32)%和(11.67±3.25)%。FRAP 测试的结果(图1C)同样表明，在每个浓度点，醇提物比水提物具有更高的还原能力，即具有更强的抗氧化能力。以抗坏血酸作为对照物质，以浓度为横坐标，清除率或OD 值为纵坐标，绘制标准曲线，将三种方法测试的提取物的清除率或OD 值代入标准曲线，即可算出提取物的抗坏血酸当量(Ascorbic acid equivalent weight，mg/g)，如图1D 所示。结果表明，ABTS 测试的醇提物的抗坏血酸当量为31.66 mg/g，即每克醇提物相当于31.66 mg 的抗坏血酸，醇提物的当量是水提物(6.10 mg/g)的5.2 倍。DPPH 和FRAP 的测定结果表明，金线莲醇提物当量分别是水提物的8.76 和4.06倍。虽然本研究中金线莲醇提物和水提物都表现出较强的抗氧化能力，但均略低于文献报道的抗坏血酸当量(70.38 mg/g)[23]，可能是因为试验方法和提取工艺的差异所致。综上所述，金线莲醇提物的抗氧化能力显著强于水提物，主要原因可能是醇提物中的总酚含量(4.19 mg/g) 高于水提物(1.22 mg/g)，因为酚类物质的含量可影响提取物的抗氧化能力[24]，其含量越高抗氧化能力越强。

3.4 金线莲提取物对酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是一种多功能含铜酶，能够催化酪氨酸生成多巴(单酚酶活性)，接着催化多巴转化为多巴醌(双酚酶活性)，多巴醌可以自发聚合形成黑色素[25]。过度的黑色素沉着会引起一些皮肤病(黄褐斑、雀斑和老年斑等)，同时酪氨酸酶也与神经退行性疾病有关，如阿尔茨海默症和帕金森病等，因此酪氨酸酶抑制剂可成为治疗这类疾病的药物[26]。金线莲醇提物对酪氨酸酶单酚酶活性的作用如图2A所示，随着醇提物浓度的增大，酶促反应的速率显著下降(直线的斜率)，当浓度达到60 mg/mL 时，以30 min 的数据计算的酶活性下降到37.8%，表明醇提物具有较强的单酚酶抑制活性。有趣的是，醇提物浓度(20 和40 mg/mL)较低时，在10 min 之前，醇提物对单酚酶不仅没有抑制作用，反而表现出激活的作用，很可能是因为醇提物中酚类物质被酪氨酸酶氧化，氧化产物在475 nm 处也有吸收而引起的。从图2B 可以看出，水提物在高浓度也具有一定的单酚酶活性抑制作用，然而与醇提物相比，抑制作用相对较弱。

图2C 显示了曲酸(Kojic acid)的双酚酶抑制活性，作为阳性对照。如图2D 所示，金线莲醇提物对酪氨酸酶的双酚酶活性同样表现出抑制作用，随着浓度的增大，酶活性逐渐下降，当浓度达到60 mg/mL 时，酶活性只剩下52.2%；而水提物的抑制作用仍然不明显，低浓度下酶活性都高于100%，主要是因为提取物中存在可以被氧化的酚类物质。导致醇提物和水提物酪氨酸酶活性抑制水平差异的主要原因可能是由于醇提物中含有大量的黄酮类化合物(8.11 mg/g)，而水提物中检测不到，因为黄酮类化合物被证明具有抑制酪氨酸酶活性的作用[27]。已有报道[27]证明，金线莲能抑制人黑色素瘤A375 细胞的酪氨酸酶活性以及黑色素合成，同样能抑制斑马鱼的黑色素生成[28]。本研究通过体外试验法进一步对其酪氨酸酶活性抑制作用进行了确证。综上所述，金线莲醇提物对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，有潜力成为酪氨酸酶相关疾病的辅助治疗药物。

图2 金线莲醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）对酪氨酸酶的作用

3.5 金线莲提取物对黄嘌呤氧化酶活性的影响

黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢的关键酶，可催化嘌呤代谢的两个步骤(次黄嘌呤→黄嘌呤→尿酸)，而尿酸的过度分泌或排泄不足会引起高尿酸血症，继而引发痛风，因此抑制黄嘌呤氧化酶的活性成为治疗高尿酸血症等疾病的关键[29]。因此，本研究评价了金线莲提取物对黄嘌呤氧化酶活性的影响，结果如图3 所示。图3A 和图3B 均表明金线莲的醇提物和水提物对黄嘌呤氧化酶的活性均没有表现出抑制作用。然而，已有临床研究[30-31]表明，金线莲对高龄老年人高尿酸血症具有明显的治疗效果。不仅如此，另有研究[14]表明，金线莲的醇提物和水提物均对黄嘌呤氧化酶有抑制作用，金线莲水提物对黄嘌呤氧化酶抑制的活性较高，浓度为1 mg/mL 时的抑制率高达96.7%，金线莲醇提物浓度为1.6 mg/mL 时的抑制率为75.7%。本研究的结果与目前文献报道的结果不一致，其原因尚不明确，因此需要有更多的试验来研究金线莲对黄嘌呤氧化酶活性的影响，以确定金线莲是否具备治疗高尿酸血症的潜力。

图3 金线莲醇提物（Ethanol extracts）和水提物（Water extracts）对黄嘌呤氧化酶的作用

4 结论

本研究比较研究了金线莲醇提物和水提物中总黄酮和总酚的含量差异，并分析了抗氧化能力及其对酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶活性影响的差异。结果发现，金线莲醇提物中总黄酮(8.11 mg/g)和总酚(4.19 mg/g)的含量均远高于水提物；三种抗氧化测试方法的测试结果一致，表明醇提物抗氧化能力强于水提物，约为4～8 倍；酪氨酸酶活性抑制试验表明醇提物对单酚酶和双酚酶均有抑制作用，而水提物未表现出明显的抑制作用；黄嘌呤氧化酶活性抑制试验表明金线莲提取物对其活性没有影响，这与文献报道的结果不符，仍有待进一步验证。总之，上述结果表明醇提物因其中富含黄酮类和酚类物质，在抗氧化能力和酪氨酸酶抑制方面具有较强的优势，为进一步开发金线莲相关产品提供了理论依据和数据支持。