基于HPLC-MS/MS技术快速鉴定灵芝化学成分

姬利强 李山雷 王运杰姬世显王宏琳李昌勤

1.河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心，河南 开封 475004；2.河南龙丰食用菌产业研究院有限公司，河南 濮阳 457300；3.开封市保健食品功效成分研究重点实验室，河南 开封475004

灵芝(Ganoderma)，又被称为瑞草、神芝、仙草和瑶草等，为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss，exFr.) karst 或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子实体[1]。灵芝是我国重要的药食两用食用菌，其资源丰富，主要分布于浙江、江西、贵州、云南、福建等地。灵芝含有多种化学成分，活性成分以三萜类、多糖类、氨基酸、核苷类、甾醇类、黄酮类为主[2-5]。在我国，灵芝已有两千多年的药用历史。现代药理学研究[6-8]表明，灵芝具有抗癌、保肝、降糖、抗炎、抗氧化、抗衰老等多种药理活性。

到目前为止，灵芝中600 多种化合物已被分离和鉴定，其中三萜类化合物种类最多，现已发现和鉴定出300 多种[9]。灵芝化合物种类繁多，药理活性复杂。本研究拟采取HPLc-MS/MS 方法对其化学成分开展研究，为探明灵芝的药效物质提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

超高效液相色谱(Waters 2D UPLC，Waters，USA)，高分辨质谱(Q Exactive，Thermo Fisher Scientific，USA)，色谱柱：Hypersil GOLD aQ 色谱柱(100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，Thermo Fisher Scientific，USA)，低 温 高 速 离 心 机(Centrifuge 5430，Eppendorf)，涡旋仪(QL-901，其林贝尔仪器制造有限公司，中国)，纯水仪(Milli-Q Integral，Millipore Corporation，USA)，冷冻真空浓缩仪(Maxi Vacbeta，GENE COMPANY)。

1.2 药品与试剂

灵芝(河南龙丰实业股份有限公司)，内标：d3-Leucine，13C9-Phenylalanine，d5-Tryptophan，13C3-Progesterone。甲醇(A454-4)、乙腈(A996-4)均为LcMS 级别(Thermo Fisher Scientific，USA)；甲酸氨(17843-250 G，Honeywell Fluka，USA)，甲酸(50144-50 mL，DIMKA，USA)，水由纯水仪提供。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil GOLD aQ 色谱柱(100 mm ×2.1 mm，1.9 μm，Thermo Fisher Scientific，USA)；流动相为含0.1%甲酸的水溶液(A 液)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B液)；采用以下梯度进行洗脱：0～2 min，5% B 液；2～22 min，5%～95% B 液；22～27 min，95% B 液；27.1～30min，5% B 液；流速为0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量为5μL。

2.1.2 质谱条件

利用Q Exactive 质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)进行一级、二级质谱数据采集。质谱扫描质核比范围为150～1500 μ，一级分辨率为70 000，AGC 为1e6，最大注入时间(IT，injection time)为100 ms。按照母离子强度，选择Top3 进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为35 000，AGC 为2e5，最大注入时 间(IT，injection time) 为50 ms，碎 裂 能 量(stepped nce)设置为：20，40，60 eV。离子源(ESI)参数设置：鞘气流速(Sheath gas flow rate)为40 单位，辅助气流速(Aux gasflow rate)为10 单位，喷雾电压(Spray voltage(｜KV ｜))正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度(Capillary temp)为320 ℃，辅助气加热温度(Aux gas heater temp)为350 ℃。

2.2 供试品溶液的制备

称取干燥灵芝100 g，使用粉碎机进行粉碎后，加10 倍量体积分数为50%的乙醇冷浸2 次，每次3 d，过滤，合并滤液浓缩并冻干。冻干粉末称重得12.8 g，得率为12.8%。称量样品50 mg。将样品送至华大基因公司进行成分检测。

2.3 MS 数据分析

本研究采用(Waters 2D UPLC waters，USA)串联Q Exactive 高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)来进行代谢物的分离和检测。使用华大高分辨植物代谢数据库(BGI High Resolution Accurate Mass Plant Metabolome Database，BGI HRAM-PMDB)(植物代谢物2 500＋)和mzCloud(化合物17 000＋，内源性代谢物3 000＋)两大标准品数据库进行成分鉴定。

2.4 化学成分分析结果

按上述“2.1”项下色谱和质谱条件进样，获得正、负离子模式下灵芝50%醇提物溶液的HPLC-MS/MS TIC 色谱图。按“2.3”项下MS 数据分析方法解析质谱数据，对灵芝50%醇提物的化学成分进行快速比对分析，共鉴定出化学成分85 个，见表1。按化合物类型分类，包括黄酮类7个，生物碱类3 个，苯丙素类5 个，萜类13 个，甾类3 个，酚类3 个，糖类2 个，核苷类12 个，氨基酸类6 个，脂肪酸类4 个，有机酸类10 个，其他类成分17 个。

表1 灵芝50%醇提物化学成分鉴定结果

续表1

续表1

续表1

续表1

续表1

3 讨论

本研究采用HPLC-MS/MS技术对灵芝子实体的体积分数50%乙醇提取物通过ESI＋、ESI-两种离子模式来进行了化学成分研究，以此提高化学成分的覆盖度。通过与标准品比对保留时间(RT)、一级质谱(MS)、二级质谱(MS2)信息，初步得到以下结果：黄酮类7 个，生物碱类3 个，苯丙素类5 个，萜类13 个，甾类3 个，酚类3 个，糖类2 个，核苷类12 个，氨基酸类6 个，脂肪酸类4 个，有机酸类10 个，其他类成分17 个。其中萜类物质是灵芝中的主要药效活性物质[10-12]，鉴定得到的三萜化合物有灵芝酸(Ganoderic acid C6)、Tsugaric acid A 等。灵芝酸为含有羧基的三萜。这些化合物通常具有复杂的结构、分子量和高亲脂性。灵芝三萜具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抑菌及抗病毒的作用[13-15]。灵芝中含有具广泛生理活性的核苷水溶性成分，实验鉴定得到的核苷类成分包括尿嘧啶(Uracil)、尿嘧啶核苷(Uridine)、腺嘧啶(Adenine)、腺嘌呤核苷(Adenosine)、鸟嘌呤(Guanine)、鸟苷和腺苷等[16]。灵芝中生物碱含量虽然较低，但有些具有重要的生理活性。生物碱能增加冠状动脉血流量、增强心肌和肌体对缺氧的耐受性，临床上对心脑血管疾病、肌无力等疾病有一定的疗效[17]。甾醇是灵芝的脂溶性成分，含量比较高。此外从灵芝中还得到大量的氨基酸、脂肪酸类、有机酸类等其他化合物。

灵芝作为我国传统的珍贵药材，具有很高的药用价值，但我国目前灵芝产业开发利用状况仍处于初级阶段。灵芝中活性成分极其复杂，既快又准确地鉴定分离出活性成分的方式仍需深入研究。