miR-183靶向Orai1基因影响高糖诱导的足细胞增殖和凋亡

李媛 孙爱东 许聿新 韩森吉

(淄博市第一医院 1内分泌科，山东 淄博 255200；2产科)

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症之一，其发生机制尚未明确。研究显示足细胞在糖尿病肾病的发生发展过程中起重要作用〔1〕。高糖(HG)是影响足细胞增殖和凋亡的重要因素，即可直接损伤足细胞，诱导细胞凋亡，又可引起足细胞裂隙膜分子的完整性受损，发生蛋白尿〔2，3〕。从分子水平探讨影响HG诱导的足细胞增殖和凋亡的机制，对于糖尿病肾病治疗靶点的寻找有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类小分子单链非编码RNA，长度为18～25个核苷酸，参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，与糖尿病、心血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关〔4～6〕。底建敏等〔7〕研究显示，miR-183可通过抑制子宫内膜癌细胞的增殖，并促进细胞凋亡，影响子宫内膜癌的发生、发展和预后。王晓晶〔8〕研究显示，miR-183在2型糖尿病中差异性表达，提示miR-183可能与糖尿病的发生发展有关。目前，还未有miR-183影响足细胞增殖和凋亡的相关报道。本研究通过HG诱导足细胞，探讨miR-183对HG诱导的足细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制，以期为糖尿病肾病的治疗寻找新靶点。

1 资料与方法

1.1细胞和实验试剂 小鼠足细胞(国家细胞库基础医学细胞中心-协和细胞库)；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和胰蛋白酶(美国Sigma公司)；LipofectamineTM2000试剂盒和Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；钙通道调节分子(Orai)1单克隆抗体(艾美捷科技有限公司)，酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3多克隆抗体(美国Abnova公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)及磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)单克隆抗体(北京中杉金桥公司)；miR-183模拟物(mimics)及模拟阴性对照物、miR-183抑制剂及阴性对照和Orai1过表达载体(上海英骏生物技术有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(上海碧云天公司)；双荧光素酶活性检测试剂盒(美国Promega公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 各细胞均用含10%FBS的RPMI1640培养基置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。每隔2 d更换1次新鲜的培养基。当细胞融合度达到80%左右时，吸弃培养基，加入适量的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

1.2.2细胞转染和分组 对数生长期的足细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。细胞融合度达到60%时，更换无FBS的培养基。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染miR-183 mimics(miR-183组)及模拟阴性对照物(miR-NC组)、miR-183抑制剂(anti-miR-183组)及抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC组)、Orai1的过表达载体(pcDNA-Orai1组)及空载体(pcDNA组)、Orai1的小干扰RNA(si-Orai1组)及乱序无意义阴性序列(si-con组)、共转染miR-183 mimics和Orai1过表达载体(miR-183+pcDNA-Orai1组)、miR-183 mimics和空载体(miR-183+si-con组)至足细胞。足细胞分为对照组(NG组)：常规培养基培养；HG6 h、HG12 h、HG24 h组：30 mmol/L的D-葡萄糖分别作用足细胞6 h、12 h、24 h。miR-183组、miR-con组、si-Orai1组、si-con组、miR-183+pcDNA-Orai1组和miR-183+si-con组细胞均使用30 mmol/L的D-葡萄糖作用24 h，并依次记为HG+miR-183组、HG+miR-con组、HG+si-Orai1组、HG+si-con组、HG+miR-183+pcDNA-Orai1组和HG+miR-183+si-con组。

1.2.3MTT检测足细胞增殖 将足细胞或转染后的各组足细胞接种于96孔板中，每孔1×103个细胞。按照上述分组处理后，每孔加入20 μl浓度为5 g/L的MTT溶液。培养箱中继续培养4 h，吸弃培养基，加入150 μl二甲基亚砜，轻轻振荡混合均匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度值(A)，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞分组和处理同1.2.3，培养48 h后，胰酶消化并收集细胞。取1.0×106个细胞，适量PBS清洗2次。吸弃PBS，加入400 μl结合缓冲液，轻轻吹打使细胞混悬。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min。再加入5 μl碘化丙啶(PI)，室温避光孵育5 min。最后再加入100 μl结合缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测。

1.2.5实时荧光定量PCR检测miR-183和Orai1 mRNA表达水平 Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，微量核酸仪测量RNA的浓度和纯度，A260 nm/A280 nm比值处于1.8～2.0范围内的RNA纯度较高。使用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR总反应体系为20 μl，扩增条件为95℃20 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共进行35个循环。miR-183上游5′-CGTAGGGCCACTGGACGA-3′，下游5′-TTGTCCCCATTCCAGCCCTG-3′；Orai1上游5′-CTGCTGGGTCAAGTTCTTA-3′，下游5′-AGTGAACAGCAAAGACGATA-3′；U6上游5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′；GAPDH上游5′-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-183以U6为内参，Orai1以GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-183和Orai1 mRNA的相对表达水平。

1.2.6Western印迹检测蛋白表达 加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，提取细胞中总蛋白。BCA蛋白试剂盒定量后，取适量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每泳道30 μg蛋白。电泳结束后，湿转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶中封闭，时间为2 h。分别加入一抗，4℃孵育过夜。再加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗IgG，室温孵育1 h。最后加入化学发光试剂ELC，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验验证miR-183与Orai1靶向关系 生物信息学软件预测显示：Orai1的3′UTR中含有与miR-183互补的核苷酸序列。PCR扩增含有与miR-183互补的Orai1的3′UTR序列，构建Orai1野生型质粒(WT-Orai1)和突变型质粒(MUT-Orai1)。分别共转染Orai1-WT、Orai1-MUT与miR-183mimic、模拟阴性对照物至足细胞。转染48 h后，收集细胞。使用细胞裂解液裂解细胞，取上清液，检测各组的荧光素酶活性。具体操作过程参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1HG刺激对足细胞增殖、凋亡及miR-183和Orai1表达影响 与NG组比较，HG6 h、HG12 h、HG24 h组细胞存活率和miR-183水平显著降低，而细胞凋亡率、酶切Caspase-3蛋白、Orai1 mRNA和蛋白水平显著升高(均P<0.05)。由于HG24 h组细胞存活率接近50%，所以选择HG作用时间为24 h作为后续实验条件。见表1，图1，图2。

表1 HG处理足细胞miR-183和Orai1的表达

图1 流式细胞术检测足细胞中Orai1蛋白表达

图2 Western印迹检测Orail、酶切Caspase-3蛋白表达

2.2上调miR-183表达对HG诱导的足细胞增殖和凋亡的影响 与HG+miR-con组比较，HG+miR-183组miR-183水平显著升高(P<0.001)，表明miR-183 mimics转染成功，足细胞中miR-183表达上调。与HG+miR-con组比较，HG+miR-183组细胞存活率显著升高(P<0.001)，细胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平显著降低(均P<0.001)。见图3，表2。

图3 足细胞凋亡相关蛋白酶切Caspase-3表达

表2 上调miR-183表达对高糖诱导的足细胞增殖、凋亡的影响

2.3miR-183靶向调控Orai1表达 生物信息学软件预测显示，Orai1的3′UTR的存在与miR-183互补的核苷酸序列。双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-con组比较，miR-183组转染WT-Orai1的荧光素酶活性显著降低(P<0.001)，说明miR-183可与Orai1的3′UTR靶向结合。见表3。Western印迹检测显示，miR-183组Orai1蛋白水平(0.23±0.04)显著低于miR-con组(0.57±0.06，P<0.05)，anti-miR-183组Orai1蛋白水平(0.833±0.08)显著高于anti-miR-con组(P<0.05)，说明miR-183靶向负调控Orai1表达。见图4，图5。

表3 双荧光素酶报告实验

图4 miR-183与Orai1互补的核苷酸序列

图5 Western印迹检测Orai1蛋白表达

2.4沉默Orai1对HG诱导的足细胞增殖和凋亡的影响 与HG+si-con组比较，HG+si-Orai1组Orai1蛋白水平显著降低(P<0.001)，与HG+si-con组比较，HG+si-Orai1组细胞存活率显著升高(P<0.001)，细胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.001)。见表4，图6。

表4 沉默Orai1表达对HG诱导的足细胞增殖、凋亡的影响

图6 足细胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表达

2.5过表达Orai1部分逆转上调miR-183表达对HG诱导的足细胞的增殖和凋亡的影响 与HG+miR-183+pcDNA组比较，HG+miR-183+pcDNA-Orai1组细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平显著升高(均P<0.001)。见图7、表5。

1，2:HG+miR-183+pcDNA组、HG+miR-183+pcDNA-Orai1组图7 足细胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表达

表5 过表达Orai1逆转上调miR-183表达对足细胞增殖和凋亡的抑制作用

2.6过表达Orai1部分逆转上调miR-183表达对HG诱导的足细胞Akt信号通路的影响 与NG组比较，HG组p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与HG+miR-con组比较，HG+miR-183组p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与HG+miR-183+pcDNA组比较，HG+miR-183+pcDNA-Orai1组p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图8，表6。

1～6:NC组、HG组、HG+miR-con组、HG+miR-183组、HG+miR-183+pcDNA组、HG+miR-183+pcNDA-Orai1组图8 足细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达

表6 过表达Orai1逆转上调miR-183表达对HG诱导的足细胞p-AKT和p-mTOR蛋白表达的影响

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病患者死亡的主要原因之一。足细胞是维持肾小球滤过膜正常通透性的主要成分，其功能受损可引起肾功能损伤，是糖尿病肾病发生、发展的关键〔9〕。HG环境可导致足细胞数量减少，足细胞从基底膜脱落等，最终导致肾小球滤过屏障通透性增加，发生蛋白尿、肾小球硬化、肾功能丧失〔10〕。本研究结果显示HG作用足细胞后，细胞增殖受到抑制，凋亡加剧，酶切Caspase-3蛋白表达水平升高，与相关研究报道结果一致〔11〕。阻止足细胞脱落、凋亡，维持其正常功能是防治及延缓糖尿病肾病发展进程的关键因素之一。

miRNA参与糖尿病的发生与发展〔12〕。miR-183是近年来新发现的一种miRNA，参与调控细胞的增殖和凋亡。于健等〔13〕研究显示，子宫内膜癌组织中miR-183呈低表达，上调miR-183表达可能通过抑制Akt1的表达抑制子宫内膜癌细胞的增殖。Wang等〔14〕研究显示，miR-183在鼻咽癌组织和细胞中表达降低，上调miR-183表达明显抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭，并促进顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡。目前miR-183对足细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究结果提示miR-183可能参与糖尿病肾病的发生和发展；miR-183是糖尿病肾病治疗的潜在靶点。

Orai1是定位于质膜上的四次跨膜蛋白，也是钙释放激活钙通道的主要成分。钙释放激活钙通道与糖尿病的发生、发展密切相关〔15〕。Zbidi等〔16〕研究显示，Orai1在2型糖尿病患者血小板中表达升高，与糖尿病的发生、发展相关。陈梦楠等〔17〕研究显示，HG在一定程度上抑制心肌细胞增殖，与HG诱导后心肌细胞中Orai1表达升高有关。目前，Orai1对HG诱导的足细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究结果提示Orai1可促进糖尿病肾病的发生和发展。提示上调miR-183表达通过下调Orai1表达影响HG诱导的足细胞增殖和凋亡。

mTOR是雷帕霉素在哺乳动物的靶分子，参与哺乳动物细胞感受营养信号、细胞增殖和生长信号的调控。Akt/mTOR信号通路参与糖尿病及糖尿病肾病的发生、发展。HG环境下，Akt/mTOR信号通路处于激活状态〔18〕。肾小球足细胞mTOR活性的异常升高是糖尿病肾病发生蛋白尿的关键机制之一。本研究结果显示，HG诱导后，足细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表达升高，与相关研究报道结果一致〔19〕，HG诱导激活了足细胞中Akt/mTOR信号通路。上调miR-183表达后，HG诱导的足细胞p-AKT和p-mTOR蛋白表达受到抑制，而过表达Orai1逆转了上调miR-183表达对HG诱导的足细胞p-AKT和p-mTOR蛋白表达的抑制作用，提示上调miR-183表达可能通过下调Orai1表达，进而抑制HG诱导的Akt/mTOR信号通路激活，保护足细胞免受损伤。

综上，miR-183在HG诱导的足细胞中表达降低，上调miR-183表达可促进HG诱导的足细胞增殖，抑制凋亡，这可能与miR-183靶向负调控Orai1表达及抑制Akt/mTOR信号通路的激活相关。