LncRNA CRNDE通过靶向miR-29a-3p对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响及其机制

孙定军 梁中书 邢波 陈漠水 张福伟

(海口市人民医院(中南大学湘雅医学院附属海口医院)心血管内科，海南 海口 570208)

动脉粥样硬化(AS)是一种常见病，其发病率呈逐年增长趋势，对人类健康造成极大的威胁〔1〕。AS的发病机制十分复杂，是一个多因素、多阶段的病理过程。研究表明，氧化应激引起的血管内皮细胞结构损伤、内皮功能障碍等是AS发生的始动环节，抑制内皮细胞损伤对AS的治疗尤为重要〔2，3〕。CRNDE是一种长链非编码RNA(LncRNA)，与肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关，可作为疾病诊断的生物学标记物及治疗的分子靶点〔4～6〕。研究显示，CRNDE在脂多糖诱导的肺成纤维Wl-38细胞中表达上调，过表达CRNDE可明显促进细胞凋亡及炎症因子表达〔7〕。目前，CRNDE对血管内皮细胞的影响还未知。生物信息学软件显示，CRNDE可能靶向结合miR-29a-3p。miR-29a-3p在脑卒中患者血清中表达下降，其表达降低可能减弱了对Kruppel样因子(KLF)4表达的抑制作用，从而促进肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-10等炎症介质的产生，加速AS进程〔8〕。本研究以建立氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞EVC-304损伤模型，探讨了CRNDE对ox-LDL诱导的EVC-304细胞氧化应激及凋亡的影响及其是否通过调控miR-29a-3p发挥作用，以期为AS的治疗提供分子靶点。

1 材料与方法

1.1细胞和实验试剂 EVC-304细胞系，中国科学院上海细胞所；胎牛血清，杭州四季青公司；DMEM培养基、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒，北京索莱宝；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，南京建成；B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体，美国Santa Cruz公司；Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒，美国Invitrogen公司；CRNDE小干扰RNA(si-CRNDE)、小干扰RNA阴性对照序列(si-NC)、miR-29a-3p模拟物(mimics)和抑制剂(anti-miR-29a-3p)、模拟对照物(miR-NC)及抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、CRNDE突变型(MUT-CRNDE)荧光素酶载体和野生型(WT-CRNDE)荧光素酶载体，上海吉凯基因公司包装合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 复苏EVC-304细胞，加含10%胎牛血清的DMEM培养基置于CO2的培养箱中培养。细胞融合至90%左右时，胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2qRT-PCR检测CRNDE和miR-29a-3p表达量 将2.5 ml对数期EVC-304细胞(2.5×104个/ml)接种于6孔板中，培养4 h后，弃培养基，分为对照(Con)组和ox-LDL组。Con组、ox-LDL组细胞分别用含0、100 μg/ml〔9〕的ox-LDL培养24 h。然后收集细胞，Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA后，行PCR。用 2-△△Ct法计算miR-29a-3p相对U6、CRNDE相对GAPDH的表达量。

1.2.3细胞转染 将2.5 ml对数期EVC-304细胞(2.5×104个/ml)接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，更换无血清培养基。利用LipofectamineTM2000试剂盒，分别转染si-CRNDE、si-NC、miR-29a-3p mimcs、miR-NC、共转染si-CRNDE与anti-miR-29a-3p、si-CRNDE与anti-miR-NC至EVC-304细胞。转染12 h后，更换为完全培养基，再培养24 h，qRT-PCR检测CRNDE或miR-29a-3p水平验证转染效果，方法同上述1.2.2，并收集细胞用于后续实验。

1.2.4酶联免疫吸附试验检测EVC-304细胞中MDA、SOD和GSH-Px水平 将2.5 ml上述1.2.3转染后的细胞(2.5×104个/ml)均接种于6孔板中，培养4 h后，均用100 μg/ml ox-LDL作用24 h，依次标记为ox-LDL+si-CRNDE组、 ox-LDL+si-NC组、ox-LDL+miR-29a-3p组、ox-LDL+miR-NC组、 ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p组、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC组。同时接种未转染的EVC-304细胞，按照上述1.2.2设置Con组和ox-LDL组。培养结束后，弃上清液，胰酶消化，收集细胞。加细胞裂解液裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，分别利用MDA、SOD和GSH-Px试剂盒检测上清液中其水平。

1.2.5流式细胞仪检测EVC-304细胞凋亡 细胞分组和处理同1.2.4，培养结束后，收集各组细胞，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加500 μl结合缓冲液，重悬细胞。加10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min。再加5 μl PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6Western印迹法检测蛋白表达 细胞分组和处理同1.2.4，培养结束后，收集各组细胞，用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，经BCA试剂盒测定蛋白浓度后，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将分离蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用5%脱脂牛奶封闭2 h。于4℃冰箱中分别用Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育过夜，洗膜后，用山羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育1 h。加显影液，避光显影，曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对GAPDH表达量。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验 将2.5 ml对数期EVC-304细胞(2.5×104个/ml)接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，更换无血清培养基。利用LipofectamineTM2000试剂盒，分别将WT-CRNDE与miR-29a-3p mimic或miR-NC、CRNDE-MUT与miR-29a-3p mimic或miR-NC共转染至EVC-304细胞。转然12 h后，更换为完全培养基，再培养24 h后，收集细胞。加细胞裂解液裂解细胞，4 500 r/min离心10 min，取上清液，利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1CRNDE和miR-29a-3p在ox-LDL诱导的血管内皮细胞中的表达 ox-LDL组血管内皮细胞EVC-304中CRNDE表达量显著高于Con组(P<0.05)，miR-29a-3p表达量显著低于Con组(P<0.05)。见表1。

表1 CRNDE和miR-29a-3p在ox-LDL诱导的血管内皮细胞中的表达

2.2沉默CRNDE表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化应激的影响 转染si-NC、si-CRNDE的EVC-304细胞中CRNDE表达量分别为1.00±0.09、0.24±0.03，两者比较差异显著(t=24.033，P<0.05)，表明沉默CRNDE的EVC-304细胞构建成功。与Con组比较，ox-LDL组MDA水平显著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)；与ox-LDL+si-NC组比较，ox-LDL+si-CRNDE组MDA水平显著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 沉默CRNDE表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化应激的影响

2.3沉默CRNDE表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡的影响 ox-LDL组血管内皮细胞EVC-304凋亡率、Bax蛋白表达量显著高于Con组(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量显著低于Con组(P<0.05)；ox-LDL+si-CRNDE组血管内皮细胞EVC-304凋亡率、Bax蛋白表达量显著低于ox-LDL+si-NC组(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达量显著高于ox-LDL+si-NC组(P<0.05)。见图1、图2、表3。

表3 表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡的影响

1～4:Con组、ox-LDL组、ox-LDL+miR-NC组、ox-LDL+si-CRNDE组，图3同图1 凋亡相关蛋白表达

图2 细胞凋亡流式图

2.4miR-29a-3p过表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响 转染miR-NC、miR-29a-3p miomics的EVC-304细胞中miR-29a-3p表达量分别为1.00±0.02、3.12±0.18，两者比较差异显著(t=35.117，P<0.05)，表明过表达miR-29a-3p 的EVC-304细胞构建成功。ox-LDL+miR-29a-3p组EVC-304细胞中MDA含量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量均显著低于ox-LDL+miR-NC组(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白表达量均显著高于ox-LDL+miR-NC组(P<0.05)。见表4和图3。

表4 miR-29a-3p过表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响

1～4：con组，ox-LDL组，ox-LDL+miR-NC组，ox-LDL+miR-29a-3p组图3 Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白表达

2.5CRNDE靶向调控miR-29a-3p的表达 生物信息学软件预测显示的CRNDE与miR-29a-3p的互补核苷酸序列见图4。共转染miR-29a-3p mimics与WT-CRNDE的EVC-304细胞荧光素酶活性低于共转染miR-NC与WT-CRNDE的EVC-304细胞(P<0.05)，而共转染miR-29a-3p mimics与MUT-CRNDE的EVC-304细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC与WT-CRNDE的EVC-304细胞比较无显著差异(P>0.05)，见表5。转染si-NC、si-CRNDE的EVC-304细胞中miR-29a-3p表达量分别为1.00±0.08、2.98±0.17，两者比较差异显著(t=31.615，P<0.05)。

图4 CRNDE的序列中含有与miR-29a-3p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-29a-3p逆转了沉默CRNDE表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的作用 共转染si-CRNDE+anti-miR-NC、si-CRNDE+anti-miR-29a-3p的EVC-304细胞中miR-29a-3p表达量分别为1.00±0.05、0.28±0.02，两者比较差异显著(t=40.110，P<0.05)，表明EVC-304细胞miR-29a-3p的表达受到抑制。ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p 组EVC-304细胞中MDA含量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量均显著高于ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC组(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白表达量均显著低于ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC组(P<0.05)。见图5和表6。

1～4：ox-LDL+si-NC组、ox-LDL+si-CRNDE组、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC组、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p组图5 各组凋亡相关蛋白表达

表6 抑制miR-29a-3p逆转了沉默CRNDE表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的作用

3 讨 论

血管内皮细胞的氧化应激损伤在AS的发生中起重要作用，与高血压、冠心病等疾病的发生发展密切相关。MDA是细胞氧化损伤的代谢产物，其含量高低可反映细胞氧化损伤程度〔10〕。SOD时机体内重要的氧自由基清除剂，可通过消除氧自由基对细胞的损伤，保护机体免受损害〔11〕。GSH-Px也是一种抗氧化酶，可清除活性氧，维持机体内的氧化还原平衡，其活力降低说明机体内存在氧化应激反应〔12〕。研究显示，ox-LDL是引起血管内皮细胞损伤的因素之一，可加速AS病变，常用于诱导内皮细胞建立损伤模型〔13〕。本研究结果显示，ox-LDL诱导血管内皮细胞EVC-304后，EVC-304细胞MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，与相关研究结果一致〔14〕，表明ox-LDL刺激诱导EVC-304细胞产生了氧化应激，细胞损伤。血管内皮细胞凋亡也参与AS的发生和发展过程，降低内皮细胞的凋亡对AS的治疗有积极意义。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2参与调控细胞凋亡，Bax表达升高，细胞凋亡加剧，而Bcl-2表达升高，细胞凋亡减弱。本研究结果显示，ox-LDL诱导后，EVC-304细胞凋亡率增加，Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，表明ox-LDL刺激可促进EVC-304细胞凋亡。

作为一种LncRNA，CRNDE参与多种疾病的发展进程。研究显示，下调CRNDE表达可提高创伤性脑损伤模型大鼠的神经行为功能，抑制炎症因子的表达〔15〕；CRNDE在硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的结肠上皮细胞系中表达升高，沉默CRNDE表达可通过上调DSS诱导的结肠上皮细胞凋亡〔16〕。目前，CRNDE对血管内皮细胞的影响还未知。本研究结果显示，ox-LDL诱导EVC-304细胞后，细胞中CRNDE表达水平明显升高，提示CRNDE参与血管内皮细胞损伤。转染CRNDE的小干扰RNA沉默CRNDE表达后，ox-LDL诱导的EVC-304细胞MDA含量降低，SOD和GSH-Px活力升高，说明沉默CRNDE表达可减轻ox-LDL诱导的EVC-304细胞氧化应激损伤。此外，沉默CRNDE表达后，ox-LDL诱导的EVC-304细胞凋亡率和Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，说明沉默CRNDE表达可抑制ox-LDL诱导的EVC-304细胞凋亡。

本研究证实了CRNDE在EVC-304细胞中靶向负调控miR-29a-3p表达。研究显示，miR-29a-3p表达的抑制可通过靶向上调Bcl-2和髓样细胞白血病(Mcl)-1等基因的表达促进小鼠巨噬细胞凋亡〔17〕；上调miR-29a-3p可抑制缺氧复氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡和氧化应激，减轻心肌缺血再灌注损伤〔18〕。本研究结果显示，ox-LDL可明显降低EVC-304细胞中miR-29a-3p的表达，而过表达miR-29a-3p抑制了ox-LDL诱导EVC-304细胞凋亡，并减轻了细胞氧化应激损伤，提示miR-29a-3p有可能成为AS治疗的分子靶点。本研究还显示，抑制miR-29a-3p表达逆转了沉默CRNDE对ox-LDL诱导EVC-304细胞氧化应激和凋亡的抑制作用，进一步说明沉默CRNDE表达可能通过靶向上调miR-29a-3p表达发挥作用。

综上所述，CRNDE在ox-LDL诱导的血管内皮细胞EVC-304中表达升高，沉默CRNDE抑制了ox-LDL诱导的EVC-304细胞氧化应激和凋亡，保护细胞损伤，其作用机制与靶向上调miR-29a-3p表达有关，CRNDE/miR-29a-3p轴可能为AS的治疗提供了分子靶点。