野生动物源肠杆菌科细菌鉴定及同源性分析

刘龙海，黄淑芳，应志豪，张秀秀，陈玎玎，龚利洋，郑应婕

(杭州动物园，浙江 杭州 310008)

肠杆菌科细菌广泛存在于人、动物和自然环境中，肠杆菌科细菌的致病性差异很大，大多数种类为条件性致病菌，可附殖于健康动物的体表和消化道，也有部分细菌为致病性菌，如沙门杆菌属、志贺杆菌属[1]。革兰氏阴性杆菌，特别是大肠埃希氏属是引起园内感染最常见细菌之一，常引发泌尿道感染、肠炎、脑膜炎、败血症等[2]。在野生动物上，肠杆菌科细菌极易感染哺乳动物和禽类，特别是幼龄动物，且死亡率较高[3]。

基于生化反应和抗原构造的分类方法，可将肠杆菌科细菌分为5个族12个属，而通过生化反应和DNA数据分析，分类更加准确细化，可将其分为25个属[4]。16S rDNA聚合酶链式反应是目前细菌鉴定中最为准确、高效的手段，通过与NCBI基因数据库中的已知菌株数据作对比，可快速确定细菌种类[5-6]。同种肠杆菌的亚型分类对肠杆菌遗传进化和溯源有重要意义，主要的方法有血清型分型法、基因重复序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等[7]。其中，ERIC-PCR 技术以其操作简单、试验重复性高和分辨力强等优点而被广泛利用，常用于肠道菌群和细菌的同源性分析[8]。Huiyong Duan 等对猪场空气和粪便分离的120株大肠埃希菌进行ERIC-PCR分析，结果发现空气分离菌来自于粪便[9]；Soltani等通过凝胶电泳从95个样本中识别出65个不同的禽大肠杆菌菌株，其中有232～2690 bp条带，并在廉价和简单的分子工具中证实ERIC-PCR是一种很好的细菌基因分型技术[10]。在其他细菌的基因分型中，也有研究验证了ERIC-PCR的可行性，李鹏等根据副猪嗜血杆菌 15 种血清型的特异性 ERIC 指纹图谱，对中国东南部不同猪场的111株副猪嗜血杆菌样品进行鉴定，验证了ERIC-PCR在其他细菌基因型分型的应用[11]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 从患病野生动物的患处脓液、死亡动物内脏、野生动物生活环境中经分离的细菌，经生化鉴定的肠杆菌科细菌38株。

1.1.2培养基及试剂 生化鉴定试剂盒、营养肉汤培养基、麦康凯培养基、营养琼脂培养基、细菌DNA提取试剂盒、细菌16S rDNA扩增试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、超纯水、50×TAE缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)、Premix Taq(大连宝生物有限公司)。

1.1.3仪器设备 恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、PCR仪(赛默飞世尔科技)、电泳仪(北京六一有限公司)凝胶成像仪(北京科锐创新科技有限公司)、微量移液枪(Eppendorf)。

1.2方法

1.2.1细菌DNA的提取 使用Takara公司，细菌提取试剂盒提取保存细菌的DNA。

1.2.216S rDNA和ERIC-PCR扩增 使用Takara公司的细菌16S rDNA的鉴定试剂盒，扩增保存肠杆菌DNA的16S rDNA序列，对扩增PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检验是否扩增成功。将扩增产物送华大基因(北京)测序，并将结果在NCBI数据库中比对。

用于ERIC-PCR扩增的引物序列参照文献设计，上游引物为：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；下游引物为：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAG CG-3′。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸3 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。对扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

2 结果

2.1肠杆菌科细菌16S rDNA鉴定结果 38株肠杆菌科细菌的16S rDNA扩增片段(部分)琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

图1 38株肠杆菌科细菌的16S rDNA扩增片段(部分)琼脂糖凝胶电泳图

扩增片段经华大基因公司(杭州)测序后，将测序结果与NCBI数据库已有序列比对，结果发现克雷伯氏菌4株，埃希氏菌27 株，摩氏摩根菌2株，沙门氏菌1株，弗氏柠檬酸杆菌1株，哈夫尼氏菌2株，勒克氏菌1株，如表1所示。

表1 肠杆菌科细菌16S rDNA鉴定结果

使用MEGA 6.0软件，对27株埃希氏菌16S rDNA序列使用临近法构建系统发生树，结果如图2所示。

图2 27株埃希氏菌16S rDNA序列系统发生树

从构建的系统发生树中发现，置信度在90%可分为23个亚群，其中E1和E26，E5、E6、E17和E18，进化关系较近。

2.2埃希氏菌ERIC-PCR指纹图谱 对ERIC-PCR扩增产物，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，部分结果如图3所示。

图3 埃希氏菌ERIC-PCR扩增产物(部分)

通过对电泳条带统计，每株埃希氏杆菌扩增出0-8条条带，共扩增出不同条带11种，其中E5、E14、E16未扩增出条带，使用NTSYSpc2.0软件，对扩增条带进行遗传相似度分析，结果如图4所示。

图4 埃希氏菌ERIC-PCR指纹图谱遗传相似度分析

通过对ERIC-PCR 指纹图谱分析，在相似系数为0.87时，埃希氏菌属可分为18个亚群，其中E1和E22，E6和E7，E8和E23，E26和E27，E17和E18遗传相似度较高。

3 讨论

16S rDNA基因是原核生物核糖体小亚基rDNA(16S rDNA)的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，全长序列包含10个可变区，可精确指示细菌之间的亲缘关系，所含信息能反应生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。本研究，通过扩增肠杆菌的16S rDNA的全长序列、测序和比对，确定了临床分离细菌7个属38株肠杆菌科细菌。利用16S rDNA序列信息，进一步通过MEGA6.0软件构建27株埃希氏菌属细菌系统发生树，若把置信度定位在90%时，则可以分为23个亚群。在确定遗传关系上，ERIC-PCR指纹图谱技术比16S rDNA基因分析更具有鉴别性[12]。本文中77.8%(n=21)埃希氏菌属细菌ERIC-PCR电泳结果显示出独特条带，表明菌株之间非相同菌株传播。经遗传聚类分析，在相似系数为0.87时，埃希氏菌属菌可分为18个亚群，显示其传播情况为非同株菌的爆发式传播。

在本研究中，通过16S rDNA序列信息构建的系统发生树中，置信度在90%时，可分为23个亚群，其中E1和E26，E5、E6、E17和E18，进化关系较近；而在通过对ERIC-PCR 指纹图谱分析，在相似系数为0.87时，埃希氏菌属菌可分为18个亚群，其中E1和E22，E6和E7，E8和E23，E26和E27，E17和E18遗传相似度较高。从两种分析结果来看有所差异。然而，在ERIC-PCR 指纹图谱分析时，在相似系数为0.75时，可分为12个亚群，排除未出现条带的E5、E14、E16，有1个亚群包含16S rDNA序列信息构建的系统发生树中置信度大于90%的所有菌株。

本研究中，通过细菌的16S rDNA快速鉴定细菌种类，并结合ERIC-PCR 指纹图谱分析快速分析出埃希氏菌属细菌的遗传关系，在今后肠杆菌科细菌感染的快速鉴定、分类和遗传溯源上有一定的指导意义。然而，在ERIC-PCR 指纹图谱分析中，E5、E14、E16未出现有效条带，需进一步研究，分析原因。