种鸡禽流感抗体的检测与分析

高 琛，周颖璐

(嵊州市畜牧业发展中心，浙江 嵊州 312400)

禽流感(Avian Influenza，AI)是禽类流行性感冒的简称，是由正黏病毒科，流感病毒属，A 型流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)引起的一种禽类(家禽和野禽) 、哺乳动物的高发病率、高死亡率和高变异性的重大动物传染病。

根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感(High Pathogenic Avain Influenza，HPAI)、低致病性禽流感(Low Pathogenic Avain Influenza，LPAI)或温和型禽流感(Mildly Pathogenic Avain Influenza，MPAI)。禽流感病毒可分为16个H亚型和9个N亚型。一般情况下，由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表) 所引起的禽流感称为高致病性禽流感，发病率和死亡率高、风险危害大。世界动物卫生组织(OIE) 将高致病性禽流感列为A类动物疫病[2]，我国将其列入一类动物疫病。几乎每次AI的暴发，尤其是HPAI的暴发都给当地养禽业带来沉重的打击，有时也引起人的感染、发病甚至死亡，对人类健康构成极大威胁，因此已经引起世界各国的高度关注[3]。AIV低毒力株能明显降低家禽的生产性能，引起产蛋异常和肉鸡死亡等，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强，也开始受到关注[4]。我国大规模的免疫措施收到了显著的防控效果，然而我国禽流感疫情提示，活禽运输和免疫不全面等因素是疫情的重要起因。Shingo Iwami等认为疫苗免疫虽然是控制禽流感疫情发生的有效工具，但倘若应用不当将不利于其防控[5]。

为了解潍坊市某些种鸡场种鸡禽流感的免疫抗体水平，便于更好为禽流感免疫做出评价，作者在山东工作时期应用血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)方法, 随机抽样对种鸡进行禽流感抗体检测和分析，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1试验材料

1.1.1被检血清 昌邑和寿光市9个鸡场种鸡188羽份血清。

1.1.2试剂及耗材 H5、H9亚型禽流感标准抗原。上述抗原由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。1%鸡红细胞悬液自制。96孔微量反应板，恒温箱，微量移液器及配套的吸头。

1.2试验方法

1.2.1H5亚型禽流感抗体检测

1.2.1.1微量血凝试验 (HA试验) 于微量血凝板的第一行每孔中滴加生理盐水50 μL，吸取禽流感H5亚型禽流感诊断抗原50 μL滴加于第1孔，用微量移液器混匀后吸出50 μL 加入第2孔，混匀后吸出50 μL加入第3孔，以此类推，稀释至第11孔，吸取50 μL弃去。第12孔不加抗原。于每孔加入1%红细胞悬液50 μL。手持血凝板轻轻振荡，放37℃ 15-20 min，根据血凝图像判定结果，以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价。以上试验做2次重复，取2次抗原血凝效价的平均值。

1.2.1.2微量血凝抑制试验(HI试验) 于微量血凝板的每行每孔加入生理盐水50 μL，每行第1孔加入待检血清50 μL，用微量移液器混匀后吸出50 μL 加入第2孔，混匀后吸出50 μL加入第3孔，以此类推，稀释至第11孔，吸取50 μL弃去。第12孔不加血清。每行1-12孔加入浓度为4个血凝单位的抗原，每孔50 μL；每行1-12孔加入1%红细胞，轻轻振荡，37 ℃下作用15-20 min，判定血凝抑制效价。

1.2.2H9亚型禽流感抗体检测 方法同上述HA试验和HI试验。

2 结果

昌邑和寿光市9个种鸡场抽检188羽种鸡的血凝抗体检测结果汇总于表1。

表1 昌邑和寿光市种鸡场抗体检测结果

由表1可见，这9个种鸡场共抽查了188羽份种鸡血清进行了血凝试验。其中昌邑1场到7场各抽检20份血清，H5、H9亚型禽流感免疫全部合格，合格率为100%。寿光1场抽检30份血清，H5亚型禽流感免疫合格数量为22，合格率为73.33%，H9亚型禽流感免疫合格数量为8，免疫合格率为26.67%。寿光2场抽检18份血清，H5亚型禽流感免疫合格数量为16，免疫合格率为88.89%，H9亚型禽流感免疫合格数量为11，免疫合格率为61.11%。

3 讨论

3.1抗体检测分析 通过试验表明，昌邑市种鸡禽流感H5、H9亚型禽流感抗体检测平均合格率为100%。结果表明这7个种鸡场的禽流感免疫做的是非常成功的，此场的肉种鸡禽流感免疫程序：16 d禽流感单价疫苗H5-5滴眼、H9颈皮下注射(0.5 DOSE)，35 d禽流感单价疫苗H5-5胸肌、H9颈皮下注射(0.5 DOSE)，11 wks禽流感单价疫苗H5-5滴眼、H9颈皮下注射(0.5 DOSE)，20 wks禽流感单价疫苗H5-5滴眼、H9颈皮下注射，25 wks禽流感单价疫苗H5-5胸肌注射、H9颈皮下注射，40 wks禽流感单价疫苗H5-5胸肌注射(备注：20周龄以后的免疫依照抗体检测情况而决定是否进行再次免疫)。寿光市两个种鸡场禽流感H5亚型禽流感抗体检测平均合格率为79.17%，H9亚型禽流感抗体检测平均合格率为39.58%。结果表明这两个场的禽流感免疫做的效果不是很好，此场48份血清中，H5亚型禽流感有10份抗体效价>12log2，H9亚型禽流感有29份抗体效价>12log2。从理论和实践方面推测寿光这两个种鸡场的种鸡被野毒株感染过。

寿光市这两个种鸡场的免疫程序和昌邑市7个场的免疫程序基本是相同的，疫苗和检测抗体也是相同的。然而两个地区的免疫合格效果却参差不齐。昌邑市7个种鸡场的禽流感H5、H9亚型禽流感抗体检测平均合格率为100%，寿光市两个种鸡场H5亚型禽流感平均合格率79.17%、H9亚型禽流感平均合格率只有39.58%。在不同的种鸡场，用相同免疫程序、疫苗和检测抗体，却造成了免疫效果的不同。通过理论和实践分析免疫效果不同的原因，可能有以下几个方面：

(1)饲养管理，昌邑市7个种鸡场在日常工作中能够按照种鸡的饲养管理方法来对鸡场的种鸡进行饲养管理。平时能够及时地打扫鸡舍的卫生，能够按时对鸡舍进行消毒，严格控制种鸡场的温度。而寿光市2个种鸡场在这些方面做得不够全面，特别是对于鸡舍的按时消毒。

(2)野毒早期感染或强毒株感染，鸡体接种疫苗后需要一定时间才能产生免疫力，而这段时间恰恰是一个潜在的危险期，一旦有野毒入侵或机体尚未完全产生抗体之前感染强毒，就导致疾病的发生，造成免疫失败。环境中的病毒超强毒株的存在可能会使种鸡机体的抗体效价高于正常标准。根据寿光市2个种鸡场H5亚型禽流感抗体效价有10份>12log2，H9亚型禽流感抗体效价有29份>12log2，推测寿光市2个种鸡场的种鸡有早期感染或强毒感染。

(3)免疫抑制性疾病，昌邑市7个种鸡场在整个饲养阶段种鸡没有患过免疫抑制疾病，而寿光市2个种鸡场在前期种鸡患过传染性法氏囊病，病毒损害了鸡的免疫器官法氏囊等，从而导致免疫抑制。特别是传染性法氏囊病病毒感染可以造成免疫系统的破坏和抑制，从而影响其它传染病的免疫。在接种禽流感疫苗时没有起到应有的作用，致使种鸡受到病毒感染。

(4)工作人员操作，工作人员操作不规范，导致接种的疫苗受到外界环境中强毒株的污染。在进行免疫时，寿光市2个种鸡场的工作人员没有进行严格的技术操作，对种鸡接种疫苗更换鸡舍时，没有进行严格的消毒，另外疫苗没有预温，导致疫苗失效。

3.2抗体检测方法的比较 酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最广泛的检测方法，比其他血清学试验敏感性好、特异性高、重复性好，特别是单克隆抗体技术和ELISA 技术的联合，成为检测病原的良好手段。薛松果通过配对试验选择1C6 和4D5 分别为包被单抗和酶标单抗，建立单抗夹心ELISA。同年蒋凤英等报道也建立了单抗夹心ELISA，主要用于检测鸡泄殖腔棉拭子样品。该方法与HA/HI 试验相比，阳性符合率为99.3%，阴性符合率为99.7%，重复性试验变异系数在8%以内。该报道中特别提到，将新鲜的尿囊液冻融一次再进行检测能很好的减少假阳性的发生，值得平时在工作中尝试ELISA 方法检测AIV，操作简单、稳定实用，特别适合基层兽医部门和鸡场AIV 进行血清学诊断和流行病学调查[13]。