C2H2锌指蛋白药物递送技术的研发与应用

李璐，魏旋，刘佳

上海科技大学 免疫化学研究所，上海 201210

1 锌指蛋白的分类及基本结构

锌指（zinc finger,ZF）广泛存在于动植物和微生物中，是细胞转录因子中的重要结构域，对基因表达的调控（抑制或激活）起重要作用[1]。锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）中含有数量不等的锌指基序，每一个锌指基序通过结合Zn2+形成稳定的类似“手指”的结构，并根据自身序列及结构特性选择性地结合特异性下游靶标DNA或RNA来实现基因表达的调控[2]。根据锌指基序序列的特点（主要是半胱氨酸 （Cys） 和组氨酸 （His）的数量和位置）可将锌指蛋白分为不同的类别，如Jeremy Berg等[3]划分的9类锌指蛋白（图1）。其中，C2H2型锌指被称为经典型锌指，具有同源保守序列：（Tyr,Phe）-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-6-His（X为可变氨基酸）[4]。

图1 目前已解析的9类锌指蛋白结构（黑字为锌指基序类型，蓝字为代表蛋白质，红字为基序序列）

2 C2H2锌指结构蛋白在基因编辑中的应用

许多人类疾病都直接或间接与遗传因素有关。“人类基因组计划”的完成为人们理解和操纵基因组提供了可能，因此应用位点特异性核酸酶对疾病相关基因序列进行修复逐渐成为疾病治疗领域的焦点[5]。目前主要有3种核酸酶被广泛应用：锌指蛋白核酸酶（zinc-finger nuclease,ZFN）、TALENs和CRISPR-Cas9（表1）。

1996年，约翰霍普金斯医学院的Kim等设计并开发了世界上第一个ZFN，将能结合DNA的C2H2锌指蛋白结构域和 FokI 限制性内切酶的核酸酶结构域融合（图2），通过改变锌指蛋白的序列改变其识别DNA的特异性，从而实现其对基因组不同位点的靶向结合[6]。除与核酸酶元件结合外，ZFP还可与转录因子、甲基转移酶等形成融合蛋白，用于基因表达调控、表观修饰等[7]。虽然新型的基因编辑工具层出不穷，但是ZFP因其自身独特性质（表1），仍被广泛应用于遗传疾病和传染性疾病的基因治疗中（表2）。2014年3月，《新英格兰医学杂志》首次报道了应用ZFN进行基因治疗的临床研究，结果表明，经ZFN改造后的CD4+T细胞对HIV病毒具有抵抗作用[8]。

表1 常用基因编辑工具比较

表2 已注册的锌指蛋白相关基因治疗的临床研究

图2 ZFN特异性识别、剪切DNA的原理示意图

目前，锌指蛋白基因治疗的领军企业为美国的生物技术公司Sangamo Therapeutics（纳斯达克上市企业），其管线包括1个临床III期、4个临床I/II期以及数个临床前的研究内容，疾病类型涵盖遗传性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等。

3 C2H2锌指蛋白细胞穿透特性的发现与研究

2012年，Scripps研究所的Barbas课题组率先探索了利用纯化的位点特异性核酸酶蛋白质进行的基因编辑技术，发现纯化的ZFN蛋白质在与哺乳动物细胞共培养时能自发穿过细胞膜并对靶基因进行高效突变[9]。与采用ZFN编码质粒进行的基因编辑技术相比，纯化的ZFN蛋白质能显著降低脱靶效率，从而提升基因编辑的特异性。这种基于核酸酶蛋白质的基因编辑体系被迅速推广至其他核酸酶工具，如TALEN[10]和CRISPRCas9[11]。

进一步的研究表明，ZFN的细胞穿透特性来源于其ZFP结构域[9]。在此基础上，Gaj和刘佳等[12]对ZFP的蛋白质序列进行了工程化改造，使其结合DNA的氨基酸突变为丙氨酸，从而不再结合DNA，而作为蛋白质递送的载体。研究发现，ZFP可有效地将融合蛋白质“货物”递送至哺乳动物细胞中。同时，与传统的细胞穿膜肽（cellpenetrating peptide,CPP）相比，ZFP具有更高的细胞穿透效率及细胞类型的广谱性[12]。对ZFP细胞穿透机理的研究发现，ZFP的穿膜过程是能量依赖的，且主要通过巨胞饮作用（macropinocytosis）和小窝蛋白介导的内吞（caveolin-dependent endocytosis）完成[12]。更重要的是，ZFP可以高效地逃逸出内体（endosome），这保证了“货物”蛋白在细胞质中的有效释放（图3）。

图3 ZFP的穿膜机制研究

4 C2H2锌指蛋白在药物递送方面的FTO分析

细胞膜的选择性通透作用，在给细胞提供保护的同时，也使得许多大分子药物（如核酸、多肽、抗体、酶）无法有效进入细胞。一般认为，细胞膜上的蛋白质靶点只占到全部基因组编码蛋白的2/3（Uniprot数据库）。因此，具有细胞穿透特性的大分子药物相比于传统大分子药物，具有更广阔的药物靶点选择空间。目前，将大分子药物递送至细胞中的方法多种多样，如脂质体、显微注射、电穿孔、病毒载体等[13]。这些方法虽然各有优势，但也存在一些共性和方法特异性的问题，如制备工艺复杂、细胞穿透效率低、细胞毒性高、免疫原性高、内体逃逸效率低、细胞类型受局限等[14-15]。

CPP作为大分子物质的细胞递送工具，无论对基础研究[16]还是疾病治疗[17]都必不可少，具有十分广阔的应用前景[18]。CPP的类型多种多样，而国际上从事C2H2锌指蛋白递送工具研究的主要为上海科技大学免疫化学研究所的刘佳团队。对C2H2锌指蛋白进行自由实施（freedom-to-operate,FTO）分析可发现，目前相关的专利均为药物蛋白（分子）专属性的专利（表3），尚未存在平台性质的专利，因此C2H2锌指蛋白递送领域仍存在进行创新药物研发的“入场空间”。

表3 C2H2锌指蛋白相关专利列表

5 C2H2锌指蛋白在药物递送方面的应用实例分析

ZFP对目前测试的所有类型细胞都表现出高效的运输效率，其中包括A431、U2OS、MDA-MB-231、DU145等癌症细胞株，以及人原代皮肤成纤维细胞[12]、原代CD4+T细胞及CD34+造血干/祖细胞[19]。在早期研究中，Gaj和刘佳等[12]发现，ZFP可将模式蛋白绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）递送至真核细胞，且递送效率与ZFP串联的数量有一定关系。同时，ZFP可将模式蛋白荧光素酶递送至细胞中，证明ZFP不会使运输的“货物”蛋白失活[12]。此外，ZFP还应用于一系列具有药物价值或治疗价值的蛋白质上。

5.1 ZFP对基因编辑核酸酶FokI的细胞递送

在发现纯化的ZFN蛋白质（ZFP-FokI融合蛋白）具有细胞穿透特性之后[9]，刘佳团队对ZFN蛋白质的制备工艺进行了改进：通过优化蛋白质纯化条件，可摆脱包涵体纯化ZFN蛋白质的方案，而用细胞裂解上清进行纯化。同时，研究人员还对ZFN蛋白质的序列进行工程化改造：在ZFN的N端连接多个核定位信号（nuclear localization signal,NLS）。这些改进极大提升了ZFN蛋白质在原代CD4+T细胞上的基因编辑效率，将3次处理才能对CCR5实现8%的敲除效率提升至1次处理即实现20%以上的敲除效率；同时，可对CCR5和CXCR4进行高效的双敲除，用于构建HIV抵抗性的CD4+T细胞[19]。

5.2 ZFP对乳铁蛋白的细胞递送

人乳铁蛋白是分子量约为80 kD的铁结合糖蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁及部分外分泌液中，具有促进肠道铁吸收、抗病毒、抗癌、免疫调节、抗氧化等多种生物学功能。乳铁蛋白不仅被广泛用于日常生活，也被用于治疗各种疾病[20]。目前，乳铁蛋白相关的疾病包括传染性疾病（如COVID-19）、癌症（如肾癌）、代谢紊乱（如腹泻）等。乳铁蛋白主要是以口服的方式被使用。特异性的乳铁蛋白受体分布于人的小肠、肝脏、骨和脑组织中，在小肠中的分布最为广泛[21]。由于受体分布相对单一，乳铁蛋白在作为营养品或药品时的吸收效果或生物利用率并不理想。刘佳与其合作者的研究发现，锌指蛋白-人乳铁蛋白融合蛋白（ZFP-hLF）可在保有乳铁蛋白抗氧化和抗菌活性的基础上，具有高效的细胞穿透效率，在人小肠上皮细胞HIEC-6中的吸收效率提升了40倍左右[20]。这个发现对提升乳铁蛋白的临床治疗效果具有重要意义。

5.3 ZFP对超氧化物歧化酶的细胞递送

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）家族包括一系列经充分研究的抗氧化酶，即SOD1、SOD2和SOD3[22]。SOD在减弱来自细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）的氧化应激中起基础作用。ROS的紊乱会导致各种疾病的发生和发展[22-23]，而临床前和临床研究均表明SOD对ROS紊乱具有很好的治疗前景[24]。SOD已被广泛应用于各种疾病的治疗，例如缺血再灌注损伤[25]、移植诱导再灌注损伤[26]、炎症[27]、帕金森病[28]、肿瘤[29-30]和获得性免疫缺陷综合征[31]。刘佳和合作者完成了ZFP-SOD1融合蛋白的构建、表达、纯化及细胞活性测试，并证明ZFP可比其他CPP更有效地递送SOD1进入真核细胞，同时可将天然折叠状态下的SOD1活性形式递送至细胞中[32]。这个发现为进一步扩展SOD的治疗潜力提供了有力支撑。

6 总结与展望

ZFP从发现至今，一直是科学家们研究的热点之一。人们发现了多种ZFP，并对它们的结构、性质和细胞穿透机制等进行深入研究。在本文中，我们总结了C2H2ZFP作为药物递送工具的相关研究，并分析了ZFP递送技术相关的专利情况。目前，虽尚未有C2H2ZFP相关的药物进入临床研究或获批上市，但为未来相关技术或药物的研发提供了想象空间。同时，对ZFP细胞穿透机理更深入的解析，也将有助于研发/优化新一代ZFP大分子药物递送工具。