免疫缺陷大鼠模型的研究进展

宋松，祝献民，范国平

上海科技大学 免疫化学研究所，上海 201210

免疫缺陷动物模型是优秀的体内研究工具，不仅能精准模拟人体，还能兼顾成本和效率。其衍生出的人源化动物模型也日益受到学术界和商业界的青睐。在免疫缺陷动物模型基础上，通过移植脐带血干细胞、胎儿骨髓、肝脏和胸腺等重建人源免疫系统，建立的人源化模型，不仅为肿瘤、干细胞、免疫等相关研究提供了重要的实验平台，而且能够用于人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）、EB病毒（epstein-barr virus,EBV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等的研究。

目前，免疫缺陷小鼠模型在科研领域得到广泛应用。由于小鼠模型存在体型小、血液等样本少、对手术技术的要求高等不足，在兼顾使用成本的前提下，大鼠成为替代小鼠的重要动物模型。大鼠体型是小鼠的10倍，因此样本多，利于原位移植。更加重要的是，大鼠在药理、毒理实验等方面已有着广泛应用，可以直接对接临床前研究。因此，建立免疫缺陷大鼠模型不仅具有重要的理论意义，更有巨大的商业价值。本文重点综述了免疫缺陷大鼠模型的研究历史和最新进展，阐述其在肿瘤、干细胞、免疫、病原微生物感染等基础和临床前研究领域的应用，并展望其广阔的应用前景。

1 免疫缺陷小鼠模型的概况

免疫缺陷小鼠模型种类丰富，应用广泛，对其他免疫缺陷动物模型的开发具有重要的借鉴价值。如图1所示，1962年出现无胸腺裸鼠（nude mouse）[1]，该品系由于Foxn1点突变而造成毛发和胸腺发育不良[2-3]。其后，日本科学家培育了NOD（non-obese diabetes）小鼠[4]。同时期，科研工作者还选育了SCID（severe combined immunodeficiency）小鼠[5]，该品系由于V（D）J重组相关的蛋白激酶（protein kinase,DNA-activated,catalytic subunit,Prkdc）突变而缺乏功能性的T和B淋巴细胞。通过干细胞打靶技术，Rag1（recombination activating gene 1）[6]和Rag2（recombination activating gene 2）[7]小鼠几乎同时被开发出来，它们都缺乏成熟的T和B细胞。随后不久，白介素2受体（interleukin 2 receptor,IL2R）γ链（Il2rg）突变的小鼠问世[8]。Il2rg是IL2、4、7、9、15和21等细胞因子共有的受体亚基，因此Il2rg小鼠严重缺乏T、B以及NK细胞。目前常用的免疫缺陷小鼠模型都是通过以上模型的杂交选育得到的。这些小鼠模型包括NOD/Scid[9]、NOD/Shi-Scid Il2rg−/−（NOG）[10]、BALB/c Rag2−/−Il2rg−/−（BRG）[11]、NOD/LtSz-Scid Il2rg−/−（NSG）[12]和NOD/Rag1−/−IL2rg−/−（NRG）[13]。免疫缺陷小鼠模型的发展，尤其是相关的突变基因和表型，为其他物种免疫缺陷模型的研发提供了重要的借鉴。

2 免疫缺陷大鼠模型的研究进展

从实验大鼠挪威鼠（Rattus norvegicus）诞生至今，大鼠模型已有100多年的历史，成为生物医学领域使用最广泛的动物模型之一，在免疫学、行为学、血液学、神经生物学、肿瘤学、临床前药理和毒理等诸多领域都有广泛的应用。与小鼠相比，体型上的优势使大鼠肿瘤组织的原位移植等手术操作更加容易，而且为下游分析提供更多的血液和组织样本。除了体型上的优势，大鼠模型的生理结构与人类更接近，能够提供更准确的病理和毒理数据，对临床治疗具有更高的参考价值[14-15]。总之，免疫缺陷大鼠模型具有独特的优势，是小鼠模型的有益补充，因而越来越受到学术界和工业界的重视。

免疫缺陷大鼠模型的发展历程比较崎岖（图1）。第一株大鼠胚胎干细胞2008年才建立成功[16]，因此大鼠的基因打靶操作比小鼠晚很多。随着锌指核酸酶（zinc-finger nuclease,ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease,TALEN）和成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）-Cas9（CRISPR-associated 9）等一系列基因编辑技术的出现和成熟，免疫缺陷大鼠模型的研究进展飞速，涌现出一大批新模型（表1）。

表1 免疫缺陷大鼠模型及特点

图1 免疫缺陷小鼠和大鼠模型的发展历程

2.1 裸大鼠

第一只裸大鼠（nude rat）在1953年由英国Rowett Institute发现，被命名为rnu[17]，但该种系在饲养不久后便淘汰了。1979年，新西兰Victoria University的Berridge等[18]报道了另一纯合裸大鼠品系，命名为rnuN。而后，经过不同近交系大鼠（具有Foxn1突变）杂交得到NIH裸大鼠，在引入Charles River公司后被命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。和裸小鼠一样，裸大鼠先天无胸腺，缺乏功能性T淋巴细胞发育场所，具有严重的先天细胞免疫缺陷。由于依然保留正常的B细胞、NK细胞以及固有免疫，裸大鼠可在开放的环境下生存4～9个月，而在SPF（specific pathogen free）环境中其寿命可延长至1.5～2年，甚至更长[19]。由于体表无毛和细胞免疫损伤等特性，裸大鼠已成功用于免疫、感染和肿瘤移植等研究。特别是在肿瘤移植领域，裸大鼠上可以移植胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌和胶质母细胞瘤等各种肿瘤，为肿瘤生长动力学、肿瘤转移和药物研发等提供了大量参考数据和经验。

2.2 X-SCID大鼠

IL2RG是位于X染色体上的编码基因，该基因突变是人产生重度联合免疫缺陷病（SCID）的最主要原因[20]。为了建立能够模拟人SCID的大鼠，Mashimo等[21]利用ZFN靶向敲除大鼠Il2rg，获得了免疫缺陷大鼠X-SCID。该大鼠胸腺发育不全，脾脏体积减小，白髓严重发育不全。外周血中白细胞数目显著减少，其中减少最为明显的亚群为CD8+T细胞、CD45RA+B细胞和CD161a+NK细胞，而CD4+T细胞在外周血、脾脏和骨髓中依然存在。X-SCID大鼠和X-SCID小鼠免疫缺陷表型基本相似。移植人卵巢癌细胞后，X-SCID大鼠顺利生长出肿瘤组织。基于X-SCID大鼠的免疫缺陷特性，2015年，Samata等[22]将胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）来源的多巴胺神经元移植到X-SCID大鼠的纹状体中，发现外源神经元细胞并没有在X-SCID大鼠的大脑中产生免疫反应。通过6-OHDA处理在X-SCID大鼠上模拟帕金森病，然后将ESC和诱导多能干细胞（induced pluripotent cell,iPSC）来源的多巴胺神经元植入纹状体，大鼠的行动能力得到恢复。这些实验表明X-SCID大鼠可用于ESC和iPSC的体内研究。

2.3 Rag1/Rag2基因敲除大鼠

Rag1和Rag2是一对位于大鼠3号染色体上的连锁基因，Rag1和Rag2复合物（又称重组酶）参与B细胞和T细胞早期发育过程中的受体V（D）J重组。Rag1和Rag2的正常表达对B细胞和T细胞的成熟具有重要作用，缺失其中任何一个基因都能造成B细胞和T细胞的发育障碍[23-24]。2012年，Zschemisch等[25]采用ZFN靶向敲除大鼠Rag1基因，Rag1基因敲除大鼠表现为胸腺严重发育不良，外周血中成熟B细胞几乎耗竭，T细胞数量严重减少，但是NK细胞补偿性增多，在脾脏和淋巴结中几乎没有淋巴细胞。与此同时，另一科研小组Ménoret等[26]利用巨核核酸酶也成功敲除大鼠Rag1基因，获得了免疫缺陷大鼠Rag1-KO。将异体大鼠的心脏移植入Rag1-KO大鼠，其心脏跳动持续了10天之久，表明免疫排斥反应在Rag1-KO大鼠中显著降低。2014年，为了建立人源肝脏大鼠模型，Tsuchida等[27]利用ZFN敲除大鼠Rag1。为了提高人源肝脏的重建率，他们手术切除新生Rag1敲除大鼠的胸腺，然后采用GM1抗体中和大鼠的NK细胞，从而获得了T细胞、B细胞和NK细胞均缺失的重度免疫缺陷大鼠。使用倒千里光碱（retrorsine）杀死大鼠肝细胞同时移植未成熟的人源肝细胞，人源肝细胞的再生比率可达17%[28]。2015年，为了建立一个能够更加高效感染天花病毒的大鼠模型，Liu等[29]建立了Rag2敲除的免疫缺陷大鼠，其免疫缺陷特征基本和Rag1敲除的免疫缺陷大鼠一致。2018年，Noto等[30]利用TALEN靶向敲除SD品系大鼠精原干细胞，通过代孕的方式也获得了Rag2缺失的免疫缺陷大鼠（命名为SDR），其免疫缺陷特征和Rag1敲除大鼠一致。皮下移植人胶质母细胞瘤细胞（U87MG）、非小细胞肺癌细胞（H358）、卵巢癌细胞（OV81）和复发性子宫内膜癌细胞（OV185），均能在SDR大鼠中成功建立人源肿瘤细胞系异种移植（cell derived xenograft,CDX）模型，而且肿瘤的生长速率显著高于小鼠模型。由于NK细胞的补偿性增多等原因，SDR大鼠接受更多肿瘤类型的能力受到限制。

2.4 SCID和FSG大鼠

2012年，同样是日本京都大学的Mashimo等[31]，通过ZFN技术分别获得基于F344品系的Prkdc单基因敲除的SCID大鼠和Prkdc与Il2rg双基因敲除的FSG大鼠。SCID大鼠和FSG大鼠胸腺严重发育不全，脾脏体积减小，CD45RA+B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD4+CD8+双阳性T细胞均严重缺失[32]。SCID大鼠NK细胞数量正常，而FSG大鼠的NK细胞由于Il2rg的敲除几乎完全缺失。在SCID大鼠和FSG大鼠上未出现SCID小鼠中出现的B细胞“泄露”现象[5]，但值得注意的是，SCID大鼠和FSG大鼠都出现比较严重的生长和繁殖能力下降以及早衰早熟等特征。SCID大鼠和FSG大鼠都展示了很好的接受外源iPSC和卵巢瘤的能力，尤其在FSG大鼠中癌细胞的生长速度更快。将人源肝细胞植入吡咯里嗪生物碱处理过的FSG大鼠肝脏后表现出较好的肝细胞接收率，表明FSG大鼠在建立肝脏人源化大鼠方面具有一定的潜力。遗憾的是，FSG大鼠因鼠源Sirpα（signal regulatory protein alpha）和人源CD47（cluster of differentiation 47）之间的不兼容性，而无法移植人源CD34+造血干细胞，很难实现免疫系统的人源化。

2.5 NSGL大鼠

CD47是一类在人体细胞普遍表达的跨膜蛋白受体，其配体SIRPα为主要表达于巨噬细胞和单核细胞的跨膜蛋白。CD47与SIRPα相互作用，向巨噬细胞发出“别吃我”信号从而介导抗巨噬细胞吞噬作用[33]。鉴于FSG大鼠巨噬细胞的Sirpα不能识别人源造血干细胞的CD47而产生移植物抗宿主反应的经验，2018年，Yang等[34]通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除大鼠的Prkdc基因和Il2rg基因，获得了免疫缺陷大鼠并命名为SG大鼠，其具有与FSG大鼠相同的免疫缺陷表型，即严重缺乏B细胞、T细胞和NK细胞，但不能移植CD34+造血干细胞。研究人员在SG大鼠的基础上，敲入人SIRPα（hSIRPα），获得了hSIRPα+Prkdc−/−Il2rg−/−的大鼠，并命名为NSG-like（NSGL）大鼠。相比于SG大鼠，NSGL大鼠产生的异种移植排斥反应强度显著降低，有着更加高效的畸胎瘤成瘤率。在移植人源CD34+造血干细胞和胎儿胸腺5周后，NSGL大鼠成功分化出了人源B细胞、T细胞、NK细胞以及巨噬细胞等人源免疫组分。

2.6 SD-RG大鼠

FSG大鼠和NSGL大鼠都是通过敲除Prkdc和Il2rg两个基因的策略来使大鼠产生免疫缺陷的，但是基于Prkdc基因敲除的大鼠具有生长受阻的明显缺陷[31]，因此本课题组He等[35]通过CRISPR/Cas9基因操作系统靶向敲除大鼠的Rag1、Rag2和Il2rg基因，在2019年报道了免疫缺陷大鼠SDRG。SD-RG大鼠的胸腺几乎完全消失，肠系淋巴结的大小和数量显著下降。与FSG和NSGL大鼠一样，SD-RG大鼠的B、T和NK细胞几乎完全缺失。将肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌细胞系进行皮下移植后，肿瘤在SD-RG大鼠中的生长速度显著大于在NSG小鼠中的生长速度，且肿瘤生长20天后的体积有着近10倍的差异。最重要的是，SD-RG大鼠建立了首例肺鳞癌的异种移植（patient derived xenograft model,PDX）模型，并较好地保留了原代肿瘤的特征。因此，SD-RG大鼠在建立大鼠PDX模型方面具有巨大的潜力。

2.7 SRG和RRGS大鼠

类似于对SD-RG大鼠的操作，Noto等[36]敲除SD大鼠的Rag2和Il2rg两个基因，获得了免疫缺陷大鼠SRG，并在2020年完成了对SRG大鼠的鉴定。SRG大鼠和SD-RG大鼠一样，缺乏成熟的T细胞、B细胞和循环NK细胞。PDX模型显示SRG大鼠对于非小细胞肺癌有着较高的植入率，并且生长的肿瘤保留了与原始患者样品高度一致的组织病理特性。同年，法国Anegon团队在敲除Rag2和Il2rg两个基因的同时，与Yang 团队不约而同地引入hSIRPα基因，建立了RRGS大鼠[37]。通过尾静脉注射人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），在RRGS大鼠中成功检测到T细胞和B细胞等人源免疫细胞组分。尽管移植人PBMC时能够引起剂量依赖的移植物抗宿主病（graft versus host disease,GVHD），但是使用一种猪抗人淋巴细胞血清可以得到缓解。此外，注射至大鼠体内的人PBMC可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

3 免疫缺陷大鼠模型的应用展望

3.1 病人来源的异种移植

PDX模型是肿瘤研究领域使用最广泛的在体模型之一，能够较好地保留原代肿瘤的组织病理、基因变异以及基因表达等特征。在免疫缺陷小鼠模型上，已成功建立大肠癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾细胞癌等多种肿瘤类型的PDX模型[38]。随着FSG、NSGL、SD-RG和RRGS等免疫缺陷大鼠模型的建立，越来越多的大鼠PDX模型也将涌现。大鼠PDX模型的一个突出的优点是非常容易进行原位移植实验，对手术操作者的技术要求较低。利用SD-RG大鼠，笔者所在实验室已经尝试患者肺癌组织的原位移植，而且在移植部位能够长出肿瘤（未发表）。目前小鼠PDX模型建模时间4～8个月不等[39]，无法有效应用于预后差的肿瘤患者。然而肿瘤在不同免疫缺陷大鼠模型上都有较快的生长速率[30,35-36]，这将大大缩短PDX模型的建模时间，为患者的个体化治疗节省更多宝贵时间。当然，肿瘤在免疫缺陷大鼠模型上生长迅速的机制还有待进一步深入探讨。同时，大鼠是传统的临床前病理和毒理模型，那么是否可以在大鼠PDX模型上将药效、病理及毒理等实验同时完成，将需要进一步实验论证。理论上，小鼠和大鼠PDX模型的移植肿瘤应该可以在免疫缺陷小鼠和大鼠模型之间互相移植，以充分发挥各自的优势，但这还需要具体实验来验证。

3.2 人源化大鼠

肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）在肿瘤的发生、增殖和转移等过程中起着重要的作用[40]，影响了对药物疗效和对治疗策略选择的评估[41-42]。传统的PDX模型无法准确再现人体的免疫环境，解决这一难题的方式是实现动物模型的免疫系统人源化，建立人源化动物模型。目前，建立人源化小鼠模型的策略主要包括将人源CD34+造血干细胞植入经γ射线照射的重度免疫缺陷小鼠中[10,12,43]，或者将人源骨髓-肝脏-胸腺（bone marrow-liver-thymus,BLT）植入重度免疫缺陷小鼠中[44-45]，最终分化出人源B、T、NK和巨噬细胞等免疫细胞。如上所述，免疫缺陷大鼠模型中只有NSGL和RRGS进行了人造血干细胞的移植，并分化出人的免疫细胞。然而，它们的局限性也非常明显。NSGL大鼠由于敲除Prkdc出现严重的生长发育障碍[31]，失去了大鼠的体型优势；RRGS大鼠在移植人PBMC后会出现移植物抗宿主病。总之，目前仍然缺乏较理想的人源化大鼠模型。笔者所在实验室已在SD-RG大鼠的基础上成功敲除CD47（未发表），从而进一步破坏巨噬细胞的功能，建立先天性和获得性免疫严重缺陷的新型免疫缺陷大鼠模型。我们即将在此基础上构建人源化大鼠模型，为肿瘤免疫的基础研究和临床应用提供崭新的动物模型平台。

3.3 干细胞研究领域

干细胞领域一直是免疫缺陷动物模型的重要应用领域。前述人源化模型即是造血干细胞在免疫缺陷动物模型上的移植。下面以肝脏为例，简要介绍免疫缺陷大鼠模型在干细胞领域的应用前景。在肝脏中，富马酸乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,Fah）缺失会导致富马酸乙酸和琥珀酰丙酮的累积，从而产生肝损伤。这种损伤可以通过补充2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基-1,3-环己烷二酮（NTBC）来缓解[46]。2007年，Azuma等[47]将Fah−/−引入Rag2−/−和Il2rg−/−双敲除的免疫缺陷小鼠，并命名为FRG。向FRG小鼠移植人源肝细胞2～3个月后，FRG最高可以达到近90%的肝脏重建率[47]，这说明人源肝脏动物模型是可行的，并且在肝脏疾病的基础研究和药物研发中都有重要价值。2016年，Kuijk等[48]成功建立大鼠肝脏干细胞，并且将其移植至Fah−/−Il2rg−/−大鼠肝脏中建立了肝脏嵌合大鼠。肝脏中存在大量定植的巨噬细胞（kupffer细胞），可能是进一步提高移植率的关键点。如果将上述的人源化大鼠模型引入Fah突变，将建立移植效率更高的模型，为干细胞治疗的临床前研究提供重要的技术支撑。

3.4 病原微生物感染领域

对于HIV、EBV、HBV和HCV等特异性感染人的病毒，其致病机理、药物和疫苗的检测都缺少有效且经济的小动物模型。人源化小鼠已相继成功用于HIV、登革热、EBV、HBV和HCV等的研究，并积累了较丰富的理论和治疗数据[49-52]。大鼠相关研究才刚起步，日本科学家在2018年报道了一种新型多瘤病毒（rattus norvegicus polyomavirus 2,RatPyV2）对于X-SXID大鼠的感染[53]。2019年与2020年之交，由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）成为世界重大公共卫生事件。虽然已有疫苗等预防和治疗药物上市，但我们还需要在相当长的时间内深入和系统地研究SARS-CoV-2感染、复制、致病和传播的机制，才有可能全面预防和治疗COVID-19。和SARS冠状病毒（SARSCoV）一样，SARS-CoV-2也是通过S蛋白（spike glycoprotein,S protein）的RBD结构域（receptor binding domain）与人类血管紧张素转化酶2（human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2）的肽酶结构域（peptidase domain,PD）相互作用进入并感染人体[54-55]。因为种属差异，SARSCoV-2病毒对小鼠等啮齿动物并无类似人类的感染和致病症状[56]。由于非人灵长类动物模型价格非常昂贵，hACE2受体的转基因小鼠应运而生[57-59]。研究表明，hACE2转基因小鼠能够感染SARS-CoV-2并引起严重的肺炎和肺功能损伤[57]，并且感染症状能够通过给予中和抗体的方式得到缓解[58]。结合上述大鼠的优势和新型基因编辑技术，开发hACE2转基因大鼠，并与人源化大鼠联用，就能得到hACE2人源化大鼠。届时，就能在这样更高效的实验动物平台上，研究SARS-CoV-2的感染机制和体内的免疫应答，同时为新药的研发提供临床前的病理和毒理数据。

4 结语

综上所述，免疫缺陷大鼠模型相比小鼠模型具有明显的优势，是实验动物模型的后起之秀。该模型的进一步优化和提升，尤其是建成人源化大鼠模型，将为肿瘤免疫治疗、干细胞治疗和抗病毒药物研发等临床前研究提供全新和有力的实验工具。