内质网应激所致细胞死亡与柯萨奇病毒B3病毒性心肌炎

郑诗悦，刘文秀，王丹，赵德超

(哈尔滨医科大学附属第一医院心血管内科，哈尔滨 150001)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是导致儿童和青年人猝死的常见心血管急症，主要病理表现为心肌局限性或弥漫性炎症改变。多种病毒感染可引起VMC，包括肠道病毒、腺病毒、巨细胞病毒、细小病毒B19、疱疹病毒6等，其中柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是最常见的感染源[1]。VMC的发病机制与CVB3感染后引起的细胞器损伤、心肌炎症反应及心肌细胞死亡(凋亡、自噬、焦亡等)有关。

内质网作为细胞的重要细胞器，是腔蛋白、分泌蛋白以及膜蛋白合成和转运的地方，也是细胞内Ca2+的储存场所，并拥有参与细胞脂质合成的大部分生物合成酶，执行多种细胞功能[2]。细胞在病毒感染、缺血、pH值变化、毒物等作用下，内质网环境改变，导致错误折叠和未折叠的蛋白质积累，内质网通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)激活一系列信号通路，进入“内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)”状态[3-4]。慢性持续ERS时，UPR会导致病理反应，使细胞死亡；但在急性情况下，UPR是一种生理反应通过维持细胞稳态确保细胞存活[5]。在外界环境刺激下，ERS的产生主要涉及 3个感受器调控的信号通路：PKR样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和激活转录因子(activating transcription factor，ATF)6。这些信号通路共同作用，参与细胞的存活与死亡[6]。现就ERS所致细胞死亡在VMC中的作用及研究进展予以综述。

1 CVB3概述

CVB3属于小RNA病毒科肠道病毒属，其遗传信息存储在一个7.4 kb大小的小单链RNA中，该单链RNA编码4个结构蛋白(VP1～4)和7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)[7]。CVB3的结构蛋白和非结构蛋白在病毒的感染、自我复制和释放中起至关重要的作用，结构蛋白构成病毒衣壳，使CVB3具有特异的抗原性；而非结构蛋白的作用是确保宿主细胞产生病毒RNA，促进细胞膜溶解，并将组装好的CVB3释放到细胞外[8]。

1.1结构蛋白与非结构蛋白 CVB3的结构蛋白VP1可破坏细胞内稳态、影响细胞周期。VP1蛋白可调节宿主细胞的细胞周期，促进病毒蛋白成功表达，增加病毒复制[9]。而其他结构蛋白VP2、VP3以及VP4的具体作用目前尚不清楚。CVB3非结构蛋白2A的主要作用是促进病毒感染宿主细胞，并产生应激颗粒，使CVB3逃逸宿主抗病毒反应，降低宿主免疫反应[10]。CVB3感染细胞后，与细胞膜上的受体结合，使其RNA进入细胞内，完成病毒复制及释放的过程。目前尚不清楚这一过程所涉及的膜受体及CVB3与膜受体结合的蛋白。近年研究发现，非结构蛋白2B作为膜结合蛋白，可诱导感染的宿主细胞产生自噬和钙稳态改变[8]。2B蛋白可以与内质网膜结合，影响内质网钙稳态，进而诱导ERS产生，促进细胞死亡，参与VMC的发生发展[8]。

1.2非结构蛋白2B 2B蛋白作为CVB3的非结构蛋白，是一种由99个氨基酸组成的多肽。2B蛋白包含两个疏水区域，一个疏水区域形成两亲水性的α-螺旋，另一个区域则形成一个完全的疏水螺旋，这两个螺旋结构由一个短的茎环连接。2B蛋白的这个螺旋-环-螺旋结构可整合到膜结构(如高尔基体膜和内质网膜)上，其是形成跨膜孔的基础[11]。这一结构特性可能是CVB3感染后产生VMC的一个病理基础。de Jong等[12]的研究证实，高尔基体是2B蛋白的靶蛋白，CVB3通过形成CVB3-2B四聚体插入到高尔基体膜内，导致高尔基体膜不稳定，诱导膜体产生囊泡，并促进病毒体在囊泡中的复制，再释放到细胞外。van Kuppeveld等[13]证实，2B蛋白可破坏内质网的钙稳态，导致Ca2+外流。但CVB3感染后是否是通过2B蛋白导致心肌细胞凋亡诱发VMC以及病理机制中是否有ERS的参与尚不清楚。

2 ERS参与VMC的发病机制

多种致病因素(缺氧、病毒感染、内质网Ca2+耗竭等)可诱发ERS。CVB3在感染过程中诱发UPR，激活不同的信号通路，诱导ERS。ERS通过增加下游炎症因子的表达，促进细胞死亡，进而加重CVB3诱导的心肌炎[14-15]。

2.1促进细胞凋亡 细胞凋亡与细胞坏死不同，凋亡是牺牲特定细胞以获得更大机体利益的一种程序性细胞死亡，是一种高度调控的细胞死亡过程，属于正常生理过程[16]。CVB3感染心肌细胞后通过磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路，调控Bcl-2样蛋白11、胱天蛋白酶(caspase)、Bcl-2相关X蛋白的表达，诱导细胞凋亡，参与VMC发展[17]。

当ERS长期存在或严重时，可通过激活PERK、IRE1和ATF6三种ERS感受器诱导细胞凋亡。①第一条信号通路是通过PERK/ATF4介导，参与调控一些靶基因的表达，如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)[18]。CHOP在ERS过程中与促凋亡蛋白的启动子结合，诱导p53上调的凋亡调节因子表达；同时，CHOP还可诱导其他促凋亡蛋白(内质网氧化还原酶-1α、生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白34、Bcl-2样蛋白11等)表达，促进细胞凋亡[19]。②第二条信号通路受IRE1感受器调控。当ERS发生时，IRE1通过剪接X盒结合蛋白1促进细胞存活[20]。但在严重ERS时，IRE1与肿瘤坏死因子受体相关因子2和凋亡信号调节激酶1结合，激活c-Jun氨基端激酶诱导细胞凋亡[21-22]。③通过嵌入内质网膜的2型跨膜蛋白激酶——ATF6感受器调控的信号通路。ATF6可以从内质网运输到高尔基体，并被切割成p50ATF6，与细胞核内的ERS反应元件的启动子结合，诱导ERS相关基因(如葡萄糖调节蛋白78)表达，进而调节促细胞凋亡基因表达[23]。Nakanishi等[24]研究发现，在ERS过程中ATF6可以激活caspase-12，促进细胞凋亡。

CVB3感染心肌细胞后，PERK、ATF6和IRE1三种ERS感受器表达上调，其中IRE1上调最显著[25]，提示ERS可能主要通过IRE1感受器影响CVB3感染诱导的心肌炎症反应。而抑制IRE1可显著减少心肌促炎症细胞因子的产生，减轻VMC，其机制与抑制核因子κB活化有关[25]。表明干扰ERS感受器的表达可能成为VMC的新治疗策略。研究发现，在CVB3感染的心肌细胞中可观察到钙黏素表达下调，而ERS相关蛋白(葡萄糖调节蛋白78、PERK、真核翻译起始因子2α、ATF4、CHOP)表达上调[26]。钙黏素作为一种钙结合蛋白，可通过调节内质网中Ca2+的流动，影响心肌细胞的收缩与舒张。因此，增加钙黏素的表达可以减少Ca2+外流，减轻ERS，抑制细胞凋亡，最终减轻VMC所致的心力衰竭，这可能成为治疗VMC的有效靶点。Nie等[27]研究发现，CVB3感染心肌细胞后，ERS依赖的细胞内Ca2+超载可激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ，抑制ERS，从而间接使细胞内Ca2+积累减少，降低钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ活性，延缓VMC发展。综上可知，CVB3感染后可促进ERS的产生，其主要通过影响内质网Ca2+流动及细胞内Ca2+变化，诱导心肌细胞凋亡，导致VMC的发生发展。因此干预ERS及ERS感受器的表达，减轻内质网Ca2+外流，抑制细胞内Ca2+超载，减轻心肌炎症反应，可能成为治疗VMC的一个潜在靶点。

2.2促进细胞自噬 自噬是维持细胞动态平衡的一种重要的进化保守机制，ERS与细胞自噬的激活密切相关。ERS诱导的细胞自噬主要包括内质网吞噬和ERS介导的自噬。内质网吞噬的相关信号通路涉及自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg)40/内质网自噬标记蛋白，其过程为自噬小体选择性地包裹并降解内质网膜，最终导致内质网吞噬。ERS介导的自噬是以产生自噬小体为特征，这些自噬小体包括破损的蛋白质、蛋白质聚集体和受损的细胞器，通过激活PERK、IRE1和ATF6三种ERS感受器诱导细胞自噬[28]。CVB3感染心肌细胞后可激活PERK、IRE1和ATF6三种ERS感受器，诱导心肌细胞自噬，促进VMC发展[29]。PI3K/mTOR信号通路参与了CVB3感染诱导的自噬过程，抑制PI3K和mTOR的功能可抑制CVB3复制，减少病毒蛋白的表达，从而抑制细胞自噬，减轻细胞炎症反应[30]。研究表明，CVB3感染心肌细胞后可激活胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，通过增加自噬小体的数量促进细胞自噬，加重心肌细胞损伤；而抑制ERK活性后自噬小体数量显著减少[31]。提示CVB3诱导的自噬小体积累可能通过ERK途径引发。Mohamud等[32]的研究发现，CVB3感染心肌细胞后还可诱导一种非典型自噬。这种自噬绕过了PI3K信号通路，最终汇聚到Atg5-Atg12-Atg16L1信号通路上，参与VMC的发生发展。可见，CVB3感染后可能通过上述信号通路直接或间接诱导心肌细胞自噬，这可能是VMC潜在的发病机制。当ERS严重时，ERS诱导的自噬和凋亡可相互串扰，它们之间存在共同的上游信号通路，包括PERK/ATF4、IRE1、ATF6等。自噬可通过降低caspase级联反应抑制细胞凋亡，减轻细胞损伤；而caspase的激活可以降解自噬相关蛋白(Atg4、Atg3、Bcl-1等)，抑制细胞自噬[33]。因此，在ERS条件下，细胞自噬与凋亡通过共同的上游信号通路相互串扰，在VMC中发挥重要作用，但具体哪种途径诱导的细胞死亡占主导作用有待进一步研究(图1)。

PERK:PKR样内质网激酶；IRE1:肌醇需求酶1；ATF:激活转录因子；eIF2α:真核翻译起始因子2α；XBP:X盒结合蛋白；CHOP:C/EBP同源蛋白；GADD34:生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白34；PUMA:p53上调的凋亡调节因子；ERO-1α:内质网氧化还原酶-1α；Bim:Bcl-2样蛋白11；ASK1:凋亡信号调节激酶1；TRAF2:肿瘤坏死因子受体相关因子；JNK:c-Jun氨基端激酶；GRP78:葡萄糖调节蛋白78；caspase:胱天蛋白酶；ERS：内质网应激

2.3促进细胞焦亡 细胞焦亡是一种不同于凋亡和自噬的新型程序性细胞死亡方式。细胞焦亡是以细胞核和胞质凝聚为主要特征，激活caspase级联反应，导致质膜破裂并释放白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18等炎症因子，引起细胞死亡[34]。越来越多的证据表明，细胞可通过caspase-4/5/11介导的非经典途径和caspase-1介导的经典途径(人caspase-4/5、小鼠caspase-11)诱导焦亡[35-37]。Yu等[38]发现，CVB3感染后小鼠心肌细胞的钙蛋白酶被激活，并激活下游核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)、caspase-1和caspase-11，而抑制钙蛋白酶可显著抑制NLRP3、caspase-1和caspase-11的表达，减少细胞焦亡，减轻心肌细胞损伤及心脏炎症，提高小鼠的存活率。因此，抑制钙蛋白酶可抑制典型的NLRP3/caspase-1途径和非典型的caspase-11途径介导的细胞焦亡，减轻VMC，这为VMC的治疗提供了新视角。

Wang等[39]还观察到，CVB3感染后心肌细胞中的组织蛋白酶B(Cathepsin B，CatB)被显著激活，NLRP3炎症小体表达增加，产生细胞焦亡。基因消融CatB后可减少NLRP3炎症小体的表达，减少炎症细胞浸润，显著提高小鼠存活率，提示CatB可通过激活NLRP3，促进细胞焦亡，从而加重CVB3诱导的VMC[39]。CVB3感染海拉细胞后IL-18和NLRP3表达增加，caspase-1活化，引起细胞焦亡[40]。应用caspase-1抑制剂后，CVB3的复制率明显降低，细胞焦亡被抑制，VMC减轻。由此可推测，抑制caspase-1可抑制下游NLRP3炎症小体，从而抑制细胞焦亡，这一发现可能为VMC提供新的治疗策略。研究表明，ERS是NLRP3炎症小体激活的重要因素：ERS可通过调节钙稳态、促进氧化应激等途径激活NLRP3炎症小体，促进下游炎症因子IL-1β表达，进而诱导炎症反应参与炎症疾病[41]。但在VMC中，ERS与细胞焦亡的关系及其相关信号通路文献报道较少，因此未来需要进一步研究以阐明ERS、细胞焦亡、VMC之间相互作用的潜在机制，以便设计新的药物控制VMC中的ERS和炎症反应。

2.4促进铁死亡 铁死亡不同于其他形式的细胞死亡，是一种铁依赖的程序性细胞死亡。铁死亡的主要机制为：在二价铁或酯氧合酶的作用下催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡，其特征是通过Fenton反应产生的活性氧类导致脂质过氧化。铁死亡通过ERS途径参与糖尿病的心肌缺血再灌注损伤。在糖尿病心肌缺血再灌注损伤过程中，抑制ERS可减少细胞铁死亡，减轻心肌损伤[42]。具体机制可能为铁离子与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶相互作用并产生活性氧类，触发ERS，ERS与活性氧类相互作用诱发铁死亡[42]。目前仅初步证实了铁死亡的发生伴随ATF4/CHOP通路的激活，诱导产生ERS，影响心肌细胞损伤，但是否也通过其他相关信号通路诱导产生ERS研究较少。另有研究发现，铁死亡可与其他类型的细胞死亡(如凋亡)相互串扰[43]。凋亡和自噬已被证实参与了VMC的发病过程，因此推测铁死亡也可能参与了VMC的发病过程。上面提到，PERK/ATF4通路介导的ERS参与了CHOP等多个靶基因的表达调控，诱导p53上调的凋亡调节因子、生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白34、内质网氧化还原酶-1α、Bcl-2样蛋白11等凋亡因子的表达，从而诱导细胞凋亡。研究显示，铁死亡也可诱导p53上调的凋亡调节因子表达，p53上调的凋亡调节因子在铁死亡与细胞凋亡之间的串扰中起重要作用[44]。但有关铁死亡是否参与了VMC的发病机制以及ERS诱导细胞铁死亡涉及的信号通路研究较少。

3 小 结

虽然VMC的发病机制尚未明确，但很多研究提示ERS通过促进细胞死亡参与了VMC的发生发展。所以，有效干预并减轻ERS可能成为治疗VMC的新方法。目前，有药物(如苯丁酸钠)通过抑制ERS减轻了细胞凋亡。苯丁酸钠可用于治疗与蛋白质错误折叠有关的疾病，减轻ERS，抑制细胞凋亡[45]，但苯丁酸钠具体通过哪种信号通路抑制ERS，以及其在VMC中是否发挥作用尚未明确。另有文献报道，褪黑素可通过调节细胞凋亡和自噬水平改善左心室功能，显著减轻CVB3诱导的心肌炎[46]，但其是否通过ERS起作用仍有待进一步研究。此外，铁死亡已成为研究的新热点，已被证实与ERS相关，但其在VMC中起何种作用尚不清楚。CVB3的非结构蛋白2B可以与内质网膜结合，引起Ca2+外流，产生ERS，导致细胞死亡，从而参与VMC的发生发展，但2B蛋白通过哪些ERS感受器起作用尚未有研究证实。在VMC中，对ERS及其下游信号通路的深入研究可以进一步了解VMC的发病机制，但通过干扰CVB3 2B蛋白的合成或抑制2B蛋白与内质网膜结合可能会为VMC的治疗提供新视角。