微小RNA-181a-3p表达下调对甲状腺癌细胞放射敏感性的影响及其作用机制▲

王红梅 谢 斌 陈寒超 关 虹 李春芸

(中南大学湘雅医学院附属海口医院1 检验科，2 重症医学科，海南省海口市 570203，电子邮箱：280652847@qq.com)

甲状腺癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，其在全球范围内的发病率呈快速增长趋势[1]。在1974～2013年期间，美国甲状腺癌发病率平均每年增加3.6%，病死率每年增加1.1%，已成为美国女性第5大常见癌症[2-3]。中国东部地区是甲状腺癌的高发地区,并且城市地区的患病率远远高于农村地区[4]。目前，甲状腺癌的临床治疗以手术、化疗、放疗等多模式综合治疗为主，虽然这些治疗在一定程度上延长了患者的生存期，但术后复发、耐药性及放射敏感性严重危害患者的身体健康[5]。因此，为改善甲状腺癌放射治疗的效果，有必要进行关于增强甲状腺癌细胞放射敏感性方面的研究。微小RNA(microRNA，miRNA)普遍存在于生物体中，是一类长度为18～22 nt的非编码RNA分子，能够调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生物过程[6]。miRNA在人类多种肿瘤组织中表达异常，与肿瘤的发生、发展有关，是近年来肿瘤分子研究领域的热点[7]。已有多项研究表明miRNA-21、miRNA-375等miRNA分子在多种肿瘤中发挥抑癌作用[8-9]。而miRNA-181a已被证实在宫颈癌中呈高表达，并且能够调节宫颈癌细胞的放射敏感性[10]。但目前关于miRNA-181a-3p的研究较少，本文通过检测体外培养的甲状腺癌细胞中miRNA-181a-3p的表达水平，以及抑制miRNA-181a-3p联合放射照射后细胞的活力及克隆数，探讨miRNA-181a-3p对甲状腺癌细胞放射敏感性的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 甲状腺癌细胞TPC-1(批号：BNCC337912)、BCPAP(批号：BNCC338685)购自美国菌种保藏中心；正常甲状腺上皮细胞Nthyori3-1为本实验室冻存；Lipofectamine 2000转染试剂(批号：11668027)购自美国Invitrogen公司；TRIzol试剂(批号：15596)、聚偏二氟乙烯膜(批号：BSP0161)、ECL发光液(批号：PE0030)、RIPA裂解液(批号：R0020)、二甲基亚砜(批号：D8370)、吉姆萨染色液(批号：G1015)购自北京Solarbio公司；胎牛血清(批号：10099-141)、胰蛋白酶(批号：25200056)、RPMI1640培养液(批号：61870044)购自美国Gibco公司；miRNA-181a-3p引物购自TaqMan公司；双荧光素酶报告基因检测系统与荧光素酶报告基因载体(批号：E1910)购自美国Promega公司；inhibitor control(批号：20180205)、miRNA-181a-3p inhibitors(批号：20181002)、空载质粒(批号：20180603)、短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)-丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)质粒表达载体(批号：20180105)及其对照质粒Vector(批号：20180711)、miRNA-181a-3p mimics(批号：20180402)及其对照mimic control(批号：20180321)均购自广州瑞锐博生物科技有限公司；TaKaRa反转录试剂盒(批号：RR047A)、TaKaRa实时荧光定量试剂盒(批号：RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT；批号：M2129)购自美国Sigma公司；兔抗人MAP3K5多克隆抗体(批号：PAB25031)、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体(批号：PAB27869)购自上海煊翎生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(批号：ab150077)购自美国Abcam公司。流式细胞仪购自美国BD公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司；HBS-1096B型酶标仪购自南京德铁实验设备公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；万睿视VAREX直线加速器购自上海艾因蒂克检测设备有限公司。

1.2 细胞培养与分组 正常甲状腺上皮细胞Nthyori3-1、甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP使用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞生长至融合度约80%时进行传代。收集对数生长期的TPC-1细胞，胰酶消化后重悬，以5×103个/孔接种至96孔板，细胞融合度为50% 时按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。分别将inhibitor control、miRNA-181a-3p inhibitors、空载质粒、shRNA-MAP3K5、shRNA-MAP3K5对照质粒Vector和miRNA-181a-3p inhibitors、shRNA-MAP3K5和miRNA-181a-3p inhibitors分别转染至TPC-1细胞，并相应标记为anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组、Scrambled组、shMAP3K5组、Vector+anti-miRNA-181a-3p组和shMAP3K5+ anti-miRNA-181a-3p组。另设对照组，即TPC-1细胞中只加入Lipofectamine 2000转染试剂。转染48 h后收集细胞，随后进行放射线照射。

1.3 放射线照射 使用直线加速器行6 MV X射线照射，分别以0、2、4、6、8 Gy照射未经转染的对数生长期TPC-1细胞，以及对照组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组、Vector+anti-miRNA-181a-3p组、shMAP3K5+ anti-miR-181a-3p组TPC-1细胞，源皮距100 cm照射8 h，于37℃、5%CO2、相对湿度为95%的培养箱中继续培养24 h后，用于定量PCR或MTT实验。

1.4 定量PCR检测miRNA-181a-3p表达量 收集未经转染和照射的对数期Nthyori3-1、TPC-1和BCPAP细胞，转染48 h后的对照组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组TPC-1细胞，以及不同剂量X射线照射的TPC-1细胞，研磨充分后加入TRIzol试剂提取总RNA。按照TaKaRa反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，使用TaKaRa 荧光定量试剂盒避光配制反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，ddH2O补足体系至20 μL。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。以U6为内参进行PCR扩增。U6上游引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT -3′，下游引物为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。每个RNA样品重复3次，以2﹣△△Ct法计算各组细胞中miRNA-181a-3p的相对表达量。

1.5 MTT法检测细胞活力 收集不同剂量X射线照射后的对照组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组、Vector+anti-miRNA-181a-3p组和shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3组TPC-1细胞，加入浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL，孵育4 h后吸除培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6 克隆形成实验 收集经4 Gy X射线照射的对照组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组、Vector+anti-miRNA-181a-3p组和shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组TPC-1细胞，然后于37℃培养箱内培养14 d，待细胞集落形成，使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次；加入预冷甲醇固定15 min，吉姆萨液染色30 min，洗去染液，自然晾干后进行克隆计数。每组6个复孔，实验重复5次。

1.7 蛋白印迹免疫实验 收集转染48 h后的Scrambled组、shMAP3K5组细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解，4℃下经10 000 r/min离心6 min后取上清。将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脱脂奶粉TBST液室温封闭1 h；分别加入兔抗人MAP3K5多克隆抗体(1 ∶500)和兔抗人GAPDH多克隆抗体(1 ∶250)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗涤，ECL发光显影，实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因实验 采用TargetScan在线工具(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测，发现MAP3K5 3′-UTR上存在miRNA-181a-3p的结合位点，为验证MAP3K5是否为miRNA-181a-3p的靶基因，使用Lipofectamine 2000转染试剂分别将inhibitor control、miRNA-181a-3p inhibitors、mimic control、miRNA-181a-3p mimics与MAP3K5 3′-UTR野生型载体共转染至TPC-1细胞，分别设为anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组、miRNA-NC组、miRNA-181a-3p组。于37℃培养箱内培养24 h，按照双荧光素酶报告基因检测系统说明书，以海肾荧光值为内参，应用酶标仪检测萤火虫与海肾荧光值，以两者比值作为荧光素酶活性。实验重复3次。

1.9 统计学分析 使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Nthyori3-1、TPC-1和BCPAP细胞中miRNA-181a-3p的表达情况 与Nthyori3-1细胞比较，TPC-1细胞和BCPAP细胞中miRNA-181a-3p的表达均上调，且TPC-1细胞中miRNA-181a-3p的表达量较BCPAP细胞高(均P<0.05)，故选择TPC-1细胞进行后续实验。见表1。

表1 3种细胞miRNA-181a-3p的相对表达量比较(x±s)

2.2 放射线照射诱导后TPC-1细胞中miRNA-181a-3p的表达情况 与经0 Gy照射的TPC-1细胞相比，经2、4、6、8 Gy照射的TPC-1细胞中miRNA-181a-3p表达上调，且表达量呈剂量依赖性(均P<0.05)，见表2。

表2 不同剂量放射线照射后TPC-1细胞中miRNA-181a-3p相对表达量的比较(x±s)

2.3 抑制miRNA-181a-3p表达对TPC-1细胞放射敏感性的影响 转染miRNA-181a-3p inhibitors后，TPC-1细胞中miRNA-181a-3p表达下调(P<0.05)，见表3。MTT法检测结果表明，随着X射线照射剂量增加，对照组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-181a-3p组细胞活力逐渐降低(均P<0.05)，且经4、6、8 Gy X射线照射的anti-miRNA-181a-3p组细胞活力低于其他两组(均P<0.05)，而经2 Gy X射线照射后3组细胞的活力差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。经4 Gy X射线照射后，anti-miRNA-181a-3p组细胞克隆数少于对照组和anti-miRNA-NC组(均P<0.05)，见表3。

表3 各组TPC-1细胞转染后miRNA-181a-3p相对表达量和经4 Gy X射线照射后克隆数的比较(x±s)

表4 不同剂量射线照射后各组TPC-1细胞活力的比较(x±s，A值)

2.4 miRNA-181a-3p的靶基因预测结果和双荧光素酶报告基因实验结果 通过TargetScan在线预测发现，MAP3K5 3′-UTR上存在miRNA-181a-3p的结合位点(见图1)。双荧光素酶报告基因实验结果表明，与相应的对照组比较，miRNA-181a-3p mimics与MAP3K5 3′-UTR野生型载体共转染的细胞中荧光素酶活性降低(P<0.05)，而miRNA-181a-3p inhibitors与MAP3K5 3′-UTR野生型载体共转染的细胞中荧光素酶活性增加(P<0.05)，见表5。

图1 MAP3K5 3′-UTR与miR-181a-3p的互补序列

表5 各组TPC-1细胞的荧光素酶活性比较(x±s)

2.5 敲减MAP3K5逆转miRNA-181a-3p低表达对TPC-1细胞放射敏感性的增加作用 蛋白免疫印记实验结果显示，shMAP3K5组的MAP3K5蛋白相对表达量为0.269±0.024，低于空载质粒组的0.812±0.067 (t=13.215，P<0.001)，见图2，提示转染shRNA-MAP3K5载体后成功下调TPC-1细胞的MAP3K5蛋白表达。以不同剂量X射线照射Vector+anti-miRNA-181a-3p组和hsMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组细胞，经4、6、8 Gy X射线照射后shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组细胞活力高于Vector+anti-miRNA-181a-3p组(均P<0.05)；经4 Gy照射的shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组细胞克隆数多于Vector+anti-miRNA-181a-3p组(P<0.05)。见表6。

图2 各组细胞中MAP3K5蛋白电泳图

3 讨 论

甲状腺癌的危险因素较多，包括吸烟、肥胖、辐射、遗传等，此外，从事放射、医疗等相关职业的工作人员患甲状腺癌的风险也大大增加[11-13]。多数甲状腺癌起源于甲状腺滤泡上皮细胞，包括分化型和未分化型。其中，分化型甲状腺癌患者经手术治疗后存活率较高；但未分化型甲状腺癌恶性程度高、易转移，不宜采用手术治疗，且对放化疗敏感性低，预后较差[14-15]。近年来，随着以miRNA为靶点的研究不断深入，已有研究表明miRNA-106a可调节MAPK等信号通路，并可体外抑制甲状腺癌细胞的凋亡和分化[16]；miRNA-7可通过抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭而在甲状腺癌中发挥肿瘤抑制作用[17]。miRNA-181家族包括miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c、miRNA-181d 4个成员，分别定位于3条独立染色体上，可与多种mRNA互补，参与各种生理、病理过程[18]。miRNA-181a在多种肿瘤组织中异常表达，已有相关文献报告，miRNA-181a在非小细胞肺癌和口腔鳞状细胞癌等肿瘤组织中呈低表达，能够通过调节细胞周期来抑制细胞增殖，并且与病情分级显著相关[19-20]。此外，Ke 等[10]研究发现，miRNA-181a在对放射敏感的宫颈癌组织中表达上调，可抑制辐射诱导的细胞凋亡，其表达水平可作为对放射治疗敏感的标志物。在甲状腺癌的相关研究中，miRNA-181a已被证实在甲状腺癌组织中呈高表达[21]；miRNA-181a-3p从miRNA-181a前体的3′端臂加工而来，miRNA-181a-5p从miRNA-181a前体的5′端臂加工而来，具有抑制癌细胞增殖和侵袭的作用[22]。本研究定量PCR检测结果提示，miRNA-181a-3p在甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP中表达上调，与上述结果一致。此外，经X射线照射后TPC-1细胞中的miRNA-181a-3p表达上调，且表达水平与照射剂量呈剂量依赖性(P<0.05)；但抑制miRNA-181a-3p表达后，随着X射线照射剂量的增加TPC-1细胞的活力逐渐降低，经4 Gy X射线照射后细胞克隆形成数减少(P<0.05)。这表明抑制miRNA-181a-3p表达可增强TPC-1甲状腺癌细胞的放射敏感性。

通过TargetScan在线预测并进行双荧光素酶报告基因实验验证，发现MAP3K5是miRNA-181a-3p的靶基因。MAP3K5是MAP3K家族成员之一，又名细胞凋亡信号调节激酶1，可被多种促炎因子和应激损伤激活，从而激活c-Jun氨基末端激酶和p38蛋白，诱导细胞凋亡[23]。同为MAP3K家族成员的MAP3K1已被证实与乳腺癌的发病有关[24]；MAP3K10可调节癌细胞增殖和化学敏感性[25]。Pressinotti等[26]的研究表明，MAP3K5与前列腺癌的恶性程度相关。但目前尚未见针对MAP3K5与甲状腺癌之间关系的研究。本研究结果显示，经4、6、8 Gy X射线照射后shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组细胞活力高于Vector+anti-miRNA-181a-3p组(均P<0.05)；经4 Gy X射线照射的shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p组细胞克隆数多于Vector+anti-miRNA-181a-3p组(P<0.05)。这表明，敲减MAP3K5可逆转miRNA-181a-3p表达下调对TPC-1细胞放射敏感性的增加作用。

综上所述，miRNA-181a-3p在甲状腺癌细胞中表达上调，抑制miRNA-181a-3p表达可增强甲状腺癌TPC-1细胞的放射敏感性，其机制可能与MAP3K5有关。这一研究结果或可为甲状腺癌的放射治疗提供新靶点。