血清微小RNA-29a水平与妊娠糖尿病孕妇母婴结局的相关性▲

张艳梅 龚丽娜 黄 莺

(新疆维吾尔自治区人民医院产科,乌鲁木齐市 830001，电子邮箱:zymwlm@yeah.net)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期常见的合并症之一[1]。近几年，随着GDM诊断标准的修订以及生活水平的提高，GDM发病率明显升高，我国不同地区的发病率高达15%～21%[2]。GDM对母婴均可造成巨大影响，其不良结局包括妊娠高血压、巨大儿、早产等，其大多数不良结局的发生率明显高于正常孕妇[3]。一项由多个国家参与的流行病学研究表明，GDM孕妇的不良结局发生风险是血糖正常孕妇的1.75倍以上，且可随着血糖水平升高而增加[4]，没有明确的风险阈值。早期预测GDM孕妇的母婴结局以便尽早干预，是现今产科的研究热点之一。微小RNA(miroRNA,miRNA)是一种非编码单链RNA分子，在多种生理过程中均发挥重要作用[5]，其中miRNA-29a参与糖脂代谢过程，有研究表明其与2型糖尿病的发生和发展有重要的联系[6]。但目前关于miRNA-29a水平与GDM关系的临床研究较少，特别是预测GDM的母婴不良结局，更无相关研究报告。本研究探讨miRNA-29a水平与GDM孕妇母婴不良结局的相关性，现将结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 纳入2017年1月至2019年2月于新疆维吾尔自治区人民医院产科进行体检建档并诊断为GDM的245例孕妇。纳入标准：(1)孕妇年龄在20～40岁之间，均在孕早期(<3个月)于我院孕检建档并按时于我院产检，在妊娠24～28周经OGTT诊断为GDM[7]；(2)单胎妊娠；(3)临床资料完整，能够配合治疗、检查等。排除标准：(1)既往有糖尿病病史或合并其他影响血糖的疾病；(2)妊娠期患有其他严重的并发症；(3)精神异常不能配合相关检查和治疗者；(4)合并严重的心、肝功能不全；(5)合并其他自身免疫性或风湿性系统疾病。本研究经医院医学伦理委员会审查后批准通过，经患者和家属同意后签署知情同意书。

1.2 干预方法 所有孕妇均给予健康教育及饮食、运动干预，必要时给予药物治疗，包括二甲双胍、胰岛素等药物，具体干预方法参照文献[8]。所有孕妇均按时于门诊产检及随访，直至分娩结束。

1.3 观察指标 (1)一般资料：包括年龄、孕期增重情况、既往史、糖尿病、家族史、孕产史、吸烟史和饮酒史等情况，以及入组时的血压、体重、体质指数、身高。其中，吸烟和饮酒是指吸烟或饮酒>1次/周，且已经持续>3个月。(2)实验室指标：入组后立即在空腹8 h后抽取静脉血检测相关指标，包括血小板计数、血红蛋白、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、总胆固醇、LDL-C、三酰甘油、空腹血糖、空腹胰岛素、空腹C肽、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)、ALT、白蛋白、miRNA-29a等，并行餐后2h血糖(2-hour postprandial blood glucose,2hPBG)检测。 高脂血症诊断标准为空腹总胆固醇>5.72 mmol/L或空腹三酰甘油>1.7mmol/L。(3)母婴不良结局发生情况：根据《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)》[7]中有关母婴不良结局的定义，评估母婴不良结局发生情况，母体不良结局包括妊娠高血压、早产、羊水过多、剖宫产、产后出血、感染等，新生儿不良结局包括呼吸窘迫综合征、低血糖、高胆红素血症、低钙血症、巨大儿、新生儿缺血缺氧性脑病等。

1.4 实验室指标检测方法 (1)常规实验室指标：采用XT4000I血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)检测血常规，采用Cobas e601电化学发光免疫分析仪(豪夫迈·罗氏公司)检测空腹胰岛素和空腹C肽，采用全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)检测其他血生化指标。(2) miRNA-29a检测方法：所有孕妇在禁食12 h后，次日清晨采集静脉血5 mL，用TRIzol试剂盒(索莱宝有限公司，批号：170302)提取血清总RNA，检测其纯度和完整性后，用定量反转录试剂盒(TOYOBO公司，批号：20161015)将2 μg的总RNA反转录成cDNA，根据SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(大连宝生物有限公司，批号：160925)中的说明书配置20 μL PCR体系，具体包括2 μL cDNA、10 μL PCR Mix、7.2 μL ddH2O2和各0.4 μL的上、下游引物；体系加配完成后放入荧光定量PCR仪(美国BD公司，型号：BD MAX clinical)，扩增的条件为95℃预变性60 s，然后在95℃变性10 s后60℃退火延伸40 s，总共进行40个循环。每个样本设置3次重复。 miRNA-29a正向引物序列为5′-CGCGGATCCATGGTTAAAGAGCC-3′，反向引物为5′-CCCAAGCTTTCAGTATAACCATTC-3′；U6 SnRNA(内参)正向引物序列为5′-GAGTACATCTTCAAGCCATCCTG-3′，反向引物为5′-TGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC-3′。使用SDS1.4软件计算Ct值，相对于U6 SnRNA的2-△△Ct值为目的miRNA的相对表达量(计算△△Ct时，对照组的△Ct取其中位数)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验或t′检验；应用多因素Logistic回归模型分析GDM孕妇发生母婴不良结局的影响因素；应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析相关指标预测GDM孕妇发生母婴不良结局的价值，曲线下面积在0.5～0.7之间表示预测效果较低，在0.7～0.8之间表示预测效果一般，大于0.8表示预测效果较好。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 随访情况 纳入研究的245例GDM孕妇中，共有12例孕妇失访，按病例脱落处理。其余233例GDM孕妇中，168例未发生母婴不良结局(对照组)，65例出现母婴不良结局(不良结局组)，发生率为27.90%，其中32例发生母体不良结局，25例发生新生儿不良结局，8例同时出现母婴不良结局。

2.2 两组孕妇一般资料的比较 两组孕妇的年龄、糖尿病家族史等一般资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)；不良结局组的孕期增重大于对照组(P<0.05)。见表1。

2.3 两组孕妇实验室指标的比较 不良结局组孕妇的空腹血糖水平、HbA1c水平和miRNA-29a相对表达水平均高于对照组(均P<0.05)，见表2。

表1 两组孕妇一般资料的对比

表2 两组孕妇实验室指标的比较(x±s)

2.4 影响GDM孕妇发生母婴不良结局的多因素Logistic回归分析 将2.1和2.2中有统计学意义的指标作为自变量(均为连续变量)，以母婴结局作为因变量(结局良好=0，结局不良=1)，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，孕期增重、空腹血糖、HbA1c和miRNA-29a水平是GDM孕妇发生母婴不良结局的独立危险因素(均P<0.05)。见表3。

表3 影响GDM孕妇发生母婴不良结局的多因素Logistic回归分析结果

2.5 各危险因素对GDM孕妇发生母婴不良结局的预测价值 ROC曲线显示，在预测GDM孕妇发生母婴不良结局时，miRNA-29a水平的曲线下面积大于空腹血糖、HbA1c和孕期增重的曲线下面积(z分别为2.732、2.837、2.842，P值分别为0.006、0.005、0.005)。见图1、表4。

图1 不同危险因素预测GDM孕妇发生母婴不良结局的ROC曲线

表4 各危险因素对GDM孕妇发生母婴不良结局的预测价值

3 讨 论

GDM是临床常见的妊娠期并发症，且发病隐匿。孕妇长期血糖异常会导致羊水过多、胎膜早破、早产、胎儿宫内窘迫、巨大儿等并发症的发生，严重地威胁母婴的生命健康[9]。本研究纳入的233例GDM孕妇中，有65例出现母婴不良结局，发生率为27.90%。高于既往文献报告的非GDM孕妇母婴不良结局发生率(15%～21%)[2]。因此，如何在GDM早期有效、准确地预测母婴不良结局并及时干预，仍是研究的重点[10]。

miRNA-29a具有高度的保守性、发育阶段的特异性及组织的特异性，其在血浆与组织样本中的表达水平有一定相关性[11]，检测血清中各种miRNA的表达谱可用于疾病的诊断和预后判断[12]。既往miRNA-29a多用来标记卵巢及子宫肿瘤、消化道肿瘤及肝肾疾病等，近年来有学者发现其在胰岛素合成及分泌等过程中起重要作用，与2型糖尿病的发生、发展有重要关系[13]。动物实验研究显示，糖尿病大鼠的miRNA-29a水平明显高于正常大鼠[14]。临床研究也表明，miRNA-29a表达升高可增加孕妇GDM的患病率[15]。因此，目前越来越多的学者认为miRNA-29a是诊断糖尿病的一个新指标，但关于其与GDM之间的关系，特别是其对母婴结局影响的研究较少。

本研究结果显示，孕期增重、空腹血糖、HbA1c和miRNA-29a水平均与GDM孕妇发生母婴不良结局有关(P<0.05)。朱荣英等[16]的研究也显示，miRNA-29a不仅可作为早期诊断GDM的一个指标，而且与母婴不良结局的发生有一定关系。miRNA-29a与胰岛素的合成、分泌有密切关系，不仅可以在机体摄取葡萄糖和体内葡萄糖平衡中发挥重要作用，而且可以降低细胞对胰岛素的敏感性，增加胰岛素抵抗[17]。它可通过刺激炎症细胞分泌相关因子引起胰岛β细胞凋亡，抑制胰岛素的合成和分泌，在机体摄取葡萄糖和体内葡萄糖平衡中发挥重要作用[13]。miRNA-29a水平越高，抑制胰岛素分泌的作用越强，而且其可增加胰岛素抵抗，减少机体对葡萄糖的吸收和利用，降低细胞对胰岛素的敏感性，导致血糖水平的升高及不易控制[18]，使得孕妇长期处于高血糖的危害中，对孕妇和胎儿造成不良刺激。此外， ROC曲线显示，miRNA-29a的曲线下面积大于0.8，即对GDM孕妇发生母婴不良结局具有良好的预测效能，且其预测效能优于孕期增重、空腹血糖、HbA1c的预测效能。这表明miRNA-29a或可为GDM孕妇母婴结局的评估提供重要参考。

综上所述，GDM孕妇分娩前miRNA-29a水平升高时发生母婴不良结局的风险增高。miRNA-29a水平或可为GDM孕妇母婴结局的评估提供重要信息，以改善母婴结局。但由于本研究的样本量较少，且为单中心研究，所得结论仍需进行大样本、多中心的研究及长期随访加以证实。