尿液中基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶组织抑制剂-2在评价梗阻性膀胱顺应性改变中的临床研究

刘胜来，蒋利明，张 羽，田大伟，黄绪统，吴长利

顺应性是衡量膀胱功能减退的一个重要特征[1]。膀胱顺应性（bladder compliance，BC）下降持续进展的后果是上尿路功能的损害，且大多具有不可逆性，其可能的致病机制与膀胱及上尿路系统的纤维化密切相关[2-3]。尿路上皮中细胞外基质合成和降解失衡是尿路系统纤维化的主要原因[4]。临床病理资料表明，基质金属蛋白酶 -2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2） 及 基质金属蛋白酶组织抑制剂-2 （tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）在细胞外基质代谢中发挥重要作用，且在损伤的尿路上皮组织中MMP-2及TIMP-2高表达与上皮组织的纤维化密切相关[5-6]。新的研究表明尿路上皮中MMP-2及TIMP-2表达情况可在尿液中被检测[7]，且与尿路损伤程度具有高度相关性[8-9]，因此，通过检测尿液中MMP-2及TIMP-2表达可间接反映BC，有助于在前列腺增生人群中筛查膀胱顺应性患者，在不增加创伤的前提下早发现早诊断早治疗[10]。本研究通过检测尿液中MMP-2、TIMP-2的表达情况，探讨其在诊断梗阻性BC改变中的应用价值，为BC改变患者筛查及无创性诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性研究2016年11月—2020年1月就诊于天津医科大学中新生态城医院及天津医科大学第二医院患者因前列腺增生行尿动力学检查患者的临床资料，尿动力学检查诊断膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction, BOO）且20≤BC＜40 mL/cmH2O者纳入研究组。对照组为前列腺增生患者尿动力学检查诊断BOO且BC≥40 mL/cmH2O者。所有纳入研究患者除外泌尿系统肿瘤、神经源性膀胱、糖尿病、急/慢性肾功能不全、间质性膀胱炎等感染因素。经膀胱测压管留取患者残余尿于-80 ℃冻存，留取尿量至少20 mL。

1.2 材料与仪器 试剂：人基质金属蛋白酶-2/明胶酶A(MMP-2)ELISA试剂盒、人TIMP-2 ELISA高灵敏检测试剂盒（上海沪震生物科技）；原理：酶联免疫吸附法，各项检测参数均按检测试剂说明书设置。标本：解冻-80 ℃冻存尿液按说明书处理后作为检测标本；同时取早上空腹静脉血3 mL分离血清用于血清肌酐（Scr）及血清胱抑素C（CysC）的检测，使用公式估算肾小球滤过率（eGFR）=169×Scr-0.608×CysC-0.63× 年龄-0.157。仪器设备：低温离心机(德国Heraeus公司)，平底96孔酶标板(Nunc公司)，酶联免疫检测仪（Wellscan MK3型），加拿大第四代莱博瑞尿动力检测仪。

1.3 研究方法 按照国际尿控协会（international continence society，ICS）推荐标准方法进行尿动力学检测[11]。入组患者均在减少饮水前提下膀胱憋尿接近充盈状态，排出尿液无菌容器装载，并测定尿常规，尿比重大于1.030者符合要求者留取标本并快速-80 ℃冻存。残余尿使用7F膀胱测压管导出并记录，膀胱完全排空后以20 mL/min的速度泵入生理盐水，根据ICS指南记录尿动力学参数：膀胱最大容量(maximum cystometric capacity，MCC)，最大尿流率 (maximum flow rate，Qmax)，残余尿量(post void residual，PVR)，初尿意容量（first desire to void, FD），BC，最大膀胱逼尿肌收缩压(Pdet-max)。根据ICS标准报告：BC<20 mL/cmH2O为低膀胱顺应性膀胱，本研究的对象主要为BC减低范围20≤BC<40 mL/cmH2O的患者。BC的计算公式：BC=△V／△Pdet，△V为膀胱再充盈过程中容量的变化值，△Pdet为相应的逼尿肌压力变化值。

1.4 标本的检测 将留存尿液标本37 ℃条件下解冻[12]，进行2500 r/min离心5 min去除残渣，如有沉淀再次离心,取上清液进行纤维透析过滤，获得含MMP-2和TIMP-2蛋白的滤液。ELISA双抗体夹心法按照试剂盒说明书操作测定各组尿液中MMP-2、TIMP-2的含量。使用酶联检测仪490 nm波长测定标本中MMP-2和TIMP-2的OD值。分别测患者血肌酐及胱抑素C并计算eGFR[13]。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS21.0统计软件，计量资料以（）表示，比较用t检验；计数资料以频数（率）表示，比较用χ2检验，单变量logistic回归分析评估尿路标记物水平和尿动力学变量。一元线性回归评估MMP-2及MIP-2与尿动力学变量之间关系，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较 37名患者入研究组，对照组为37例，平均年龄为65.4岁，均因下尿路症状门诊就诊人群，两组患者年龄、IPSS 评分、体重指数（body mass index, BMI）、膀胱过度活动症评分（overactivity bladder symptom score, OABSS）、 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptors,eGFR比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（详见表1）。

表1 研究组与对照组患者临床资料对比

两组尿动力学参数比较：BC分别为（33.6±9.2）mL/cmH2O、（50.6 ±18.2）mL/cmH2O,两组差异有统计学意义（P＜0.05），而MCC、Qmax、PVR、 FD、Pdet-max比较，差异无统计学意义（P＜0.05）（详见表2）。

表2 研究组与对照组尿动力学参数比较

2.2 MMP-2、TIMP-2表达及与尿动力参数关系 研究组尿液MMP-2及TIMP-2含量分别为（0.75±0.26）ng/mL、(359.8±123.7) pg/mL，显著高于对照组（0.52±0.21）ng/mL、（289.8±101.9）pg/mL，差异具有统计学意义（P＜0.05）。单变量logistic和线性回归分析表明TIMP-2和MMP-2与膀胱顺应性显著相关（OR=10.9；P=0.034和OR=19.3；P=0.045），与尿动力学其他参数（Pdetmax、CC、OABSS）比较无统计学意义（P＞0.05）（见表3）。MMP-2、TIMP-2 与BC改变的特异性及敏感性（见图1）。在单变量线性回归分析MMP-2和TIMP-2与eGFR无显著相关性。

表3 MMP-2和TIMP-2与尿动力参数关系

图1 MMP-2与TIMP-2与BC相关性的ROC曲线

3 讨论

临床实践中对梗阻性膀胱改变治疗的重点是解除梗阻，梗阻解除后仍有部分患者存在下尿路症状，大多是因为术前对已继发的膀胱功能改变缺乏精确的评估[14-15]。尿流动力学检查是直观量化尿路功能评估较为理想的方法，但属有创检查，并且受膀胱容量、紧张情绪等多因素影响，对BC改变的客观事实缺乏标准化的评定[16]。尿液标本最容易获取，无创伤，易被患者所接受，被认为是探索下尿路功能障碍的有效工具。

为克服增加的尿流阻力，膀胱出口梗阻发生初期膀胱壁最先出现代偿性增生，壁内血管受压，局部出现缺血低氧[17]。局灶性缺氧持续进展线粒体氧化代谢功能受损以及慢性的尿潴留使得膀胱平滑肌细胞、成纤维细胞及上皮细胞进一步肥大、增殖，成纤维细胞中转化生长因子TGF-β和结蹄组织生长因子CTGF的基因表达水平下降，细胞内骨架蛋白、离子通道、线粒体的结构发生改变，细胞外基质成分发生变化即膀胱重塑，严重影响膀胱排空[18]。MMP-2和TIMP-2参与调节生理和病理状态下细胞外基质（extracellular matix, ECM）的合成和代谢平衡,亦可发挥其类细胞生长因子样的作用,调节系膜细胞的增殖与分化，参与继发性膀胱功能改变复杂的病理生理过程[19]。近来对ECM的研究不断明朗，抑制细胞迁移与黏附的MMP-2可激活线粒体-核应激信号，在ECM代谢调节中TIMP-2是MMP-2的负调节剂[20]，两者可能参与了BC改变引起的上尿路损害甚至慢性肾功能恶化。膀胱壁细胞外基质由大分子构成的错综复杂的网络，为肌细胞生存及活动的微环境，通过信号转导系统影响细胞的代谢、功能、迁移、增殖和分化，与膀胱的特殊功能相适应。MMP-2主要通过降解Ⅳ型胶原纤维参与病理生理过程，而Ⅳ型胶原纤维则是细胞膜及细胞外基质的主要组成成分。TIMP-2能以高度的亲和性与MMP-2结合，两者的相对浓度最终决定了MMP-2胶原降解的能力[21-22]。

在本研究中，我们发现尿TIMP-2和MMP-2可能与梗阻性患者BC改变密切相关，发现尿TIMP-2表达与BC改变合并上尿路积水损伤有关。Thurmond等[23]研究表明MMPs及其已知抑制剂（TIMPs）参与了细胞外基质的破坏和重塑，TIMPs上调可导致纤维化胶原沉积增加，促使成纤维细胞和肌纤维母细胞等间质细胞活跃，因此，膀胱出口梗阻与细胞外基质沉积增加之间存在必然联系[24-25]。梗阻致使膀胱壁增厚，膀胱平滑肌的构成发生改变的同时细胞外基质沉积导致膀胱壁纤维化，顺应性降低，细胞外基质沉积与膀胱壁纤维化可以解释传统下尿路障碍药物疗法，特别是通过防止肉毒毒素的扩散而进行的注射毒素在膀胱壁缺乏影响[26-27]。我们认为尿液中TIMP-2和MMP-2检测可有力的补充尿动力学的评估膀胱功能的变化，随着大数据样本的不断积累可能成为BC改变重要的筛选工具。

综上所述，MMP-2与TIMP-2参与了细胞外基质重塑及膀胱壁纤维化的病理生理过程，尿液MMP-2可能是膀胱顺应性改变出现尿路损伤的标志物，尿液TIMP-2表达情况也可预测梗阻性尿路损害，为梗阻性膀胱功能改变的筛查及靶点治疗提供了依据支持。本研究也存在一些不足之处，入组患者神经源性膀胱病变被排除，但高龄隐匿性神经疾病可能被纳入，导致患者群体选择偏差可能。相信随着临床实践的重视及分子机制的深入研究胱顺应性改变的难题一定能得到更好的解决。