猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达及其免疫原性分析

腾召剑，林依丹，周双海，李潭清，张义明，宋勤叶，郑士学

(1.河北农业大学动物医学院 河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071000；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 昌平 102206)

猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)与猪皮炎肾病综合征、多器官炎症以及母猪繁殖障碍等多种病症相关[1-3]。该病毒于2015年首次在美国猪场患多器官炎症的仔猪及患皮炎肾病综合征伴发繁殖障碍症状的母猪与死胎的组织中发现[4-5]，随后在中国、日本、韩国等国家和地区的猪群中检测到了该病毒，不同地区或猪场的感染率在9.6%～52.0%[1,6-7]。此外，在野猪、牛、狗、鹿及蜱等体内也检测到PCV3[8-9]，表明PCV3不仅对全球养猪生产构成了潜在威胁，而且可在家畜、野生动物和节肢动物间循环。

PCV3属于圆环病毒科圆环病毒属成员，基因组全长2 000 bp。与猪圆环病毒2(PCV2)相似，PCV3具有圆环病毒典型的基因组结构和遗传特性，包括3个主要开放阅读框(Open reading frame,ORFs)，即ORF1、ORF2和ORF3[4-5]。其中ORF1较保守，编码复制酶；ORF2容易突变，编码214 aa的衣壳(Capsid,Cap)蛋白，该蛋白是病毒入侵、复制和诱导宿主免疫应答的最重要蛋白，并且与病毒变异密切相关[10-12]；ORF3编码231 aa，其功能不详[5]。目前，对PCV3的致病机制及其编码蛋白的生物学功能了解很少，获取具有良好生物学活性的Cap蛋白对于深入了解PCV3的感染免疫特征及其防治具有重要意义。本试验旨在应用大肠杆菌表达系统，体外表达PCV3-Cap蛋白，分析蛋白的抗原表位及其免疫原性，为PCV3免疫学特性、亚单位疫苗及相关检测方法的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种与实验动物 克隆PCV3-Cap蛋白基因序列的重组质粒(pMD-PCV3-ORF2)，由本实验室构建保存；大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α、Rosetta(DE3)均由本实验室保存；BALB/c小鼠(6～8 周龄)，购自河北医科大学动物实验中心。

1.2 主要试剂EcoR Ⅰ、XhoⅠ限制性内切酶、DL10 000 DNA marker、Premixed Protein Marker(Broad)、Premixed Protein Marker(Low)，均购自宝生物工程(大连)有限公司；抗His标签兔多克隆抗体，购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白Marker Ⅱ，购自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)、His-Tagged Protein Purification Kit和羊抗兔IgG-HRP，均购自康为世纪生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)，均购自Promega公司。

1.3 PCV3-Cap蛋白基因的PCR扩增 参考PCV3 HB-1/2016毒株(GenBank登录号：MF593110)的ORF2序列，应用Oligo 6.0设计扩增Cap蛋白基因序列(不含5′端核定位序列)的特异性引物，即PCV3-e2Cap-F:5′-CGTGAATTCTACTCCACCATGAA CGTC-3′和PCV3-e2Cap-R:5′-CTGCTCGAGTTAGA-GAACGGACTTGTA-3′，分别在上下游引物的5′端引入限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ碱基序列(下划线碱基)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以重组质粒pMD-PCV3-ORF2为模板进行PCR，扩增Cap基因片段。PCR扩增体系为50 μL，包括2×TaqMaster Mix(Dye)25 μL、PCV3-e2Cap-F/R各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒纯化回收目的基因片段。

1.4 重组表达载体的构建及鉴定 用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性核酸内切酶消化纯化回收的PCR产物与质粒pET-28a(+)，回收酶切后的Cap基因与质粒pET-28a(+)；用T4 DNA连接酶连接Cap基因片段与质粒pET-28a(+)，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞；将菌液涂布到卡那霉素(Kan+)抗性(30 μg/mL)的LB固体培养基上，于37 ℃下培养18～24 h；挑取菌落接种到Kan+/LB液体培养基内振摇培养16 h，提取质粒(pET-28a-PCV3-Cap)，经PCR和EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切鉴定后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 重组蛋白的表达及其表达形式检测 将构建的重组质粒转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中，涂布到Kan+/LB固体培养基上，37 ℃下过夜培养，挑取单个菌落接种到5 mL Kan+/LB液体培养基中，37 ℃下200 r/min振摇培养，至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1、0.5、1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的IPTG，于18、21、25、28、31、34 ℃和37 ℃不同温度下、230 r/min诱导表达3、4、5 h和6 h。同时设立转化空质粒pET-28a(+)的Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)菌株作为阴性对照。收集诱导后的菌体进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表达情况，确定目的蛋白的最佳表达条件，并用His-Tagged蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。

1.6 Western Blot鉴定 取蛋白表达阳性菌株和转化空质粒菌株的诱导产物经SDS-PAGE后，将蛋白转印至PVDF膜上，将膜放入封闭液(含5%脱脂奶粉、0.05% Tween-20的PBS)中，于4 ℃封闭过夜；加入兔抗His标签多克隆抗体(1∶1 000倍稀释)，室温下反应1.5 h；洗膜，加入羊抗兔IgG-HRP(1∶3 000 倍稀释)于室温下反应1.5 h；洗膜，将膜放入显色液(DAB)中，显色3～10 min，终止反应，检测融合目的蛋白的表达情况。

1.7 基于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术的蛋白鉴定 取50 μg纯化的重组蛋白，加入糜蛋白酶进行酶切，取10 μg 酶切后肽段，经脱盐柱脱盐，于45 ℃真空干燥，用于LC-MS/MS检测。采用MaxQuant(1.6.2.10)软件对质谱数据进行分析，搜索的数据库为NCBI-PCV3。

1.8 抗原表位预测与分析 在线(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.html)预测表达的Cap蛋白与参考毒株PCV3-US/SD2016 Cap蛋白(GenBank收录号：APC65716)的抗原表位，比较两者的异同，分析表达蛋白的抗原性。

1.9 动物试验 取重组Cap蛋白以等体积的弗氏完全佐剂乳化后，背部皮下接种8只6～8周龄的BALB/c小鼠，每只50 μg蛋白/0.1 mL；同时设立阴性对照小鼠。分别间隔2周，进行第2次和第3次接种，皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白，每只50 μg 蛋白/0.1 mL。第3次接种后10 d，应用ELISA检测血清中的特异性抗体效价。ELISA主要步骤：用0.1 μg的重组Cap蛋白加入酶标板孔内，于4 ℃包被过夜；用PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L pH 7.4的PBS)洗涤3次，每孔加入100 μL 封闭液(含5%犊牛血清的PBST)，37 ℃封闭1 h；弃封闭液，加入100 μL 1∶100～1∶204 800倍比稀释的待测血清，37 ℃反应45 min；洗涤后，每孔加入100 μL 1∶5 000倍稀释的HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃ 孵育45 min；洗涤，每孔加100 μL TMB于室温避光显色15 min；每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4终止反应；用酶标仪测定各孔OD450 nm光吸收值(OD450 nm值≥0.3时，判定血清特异性抗体阳性)。

2 结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定 应用PCR扩增到了大小528 bp的Cap蛋白基因序列，构建的重组质粒经EcoR Ⅰ和XhoⅠ消化，可以释放出预期大小的目的片段(图1)，序列测定显示，在重组质粒内包含目的条带，与参考序列的同一性为100%。表明成功构建了重组表达质粒pET-28a-PCV3-Cap。

图1 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定Fig.1 Identification of the recombinant expression plasmids by PCR and restriction analysis1:阳性对照;2～3:分别为重组质粒和空质粒的PCR产物;4～5:分别为重组质粒和空质粒的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定;M:DL10 000 DNA marker1:Positive control;2-3:PCR products of the recombinant plasmid and the blank plasmid,respectively;4-5:Identification of the recombinant plasmid and the blank plasmid by restriction analysis with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ;M:DL10 000 DNA marker

2.2 蛋白的表达 转化重组质粒的菌株pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3)在31 ℃下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后，可表达预期大小(25.4 kDa)的蛋白条带。而转化空质粒的菌株pET-28a(+)/Rosetta(DE3)和工程菌Rosetta(DE3)在诱导后，均没有相应大小的蛋白条带表达(图2)。收集诱导后的菌体，经超声破碎、离心后，取上清和沉淀经SDS-PAGE检测，发现蛋白以包涵体形式表达(图略)。

图2 PCV3-Cap蛋白的原核表达Fig.2 Procaryotic expression of PCV3-Cap proteinM:预混蛋白分子量标准;1～2:IPTG诱导前后Rosetta(DE3);3～4:IPTE诱导前后的pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3)5～6：IPTE诱导前后的pET-28a(+)/Rosetta(DE3)M:Premixed orotein marker(Broad);1-2:Rosetta(DE3)before and after IPTG induction;3-4：pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3) before and after IPTG induction;5-6:pET-28a(+)/Rosetta (DE3)before and after IPTG induction

2.3 蛋白的Western Blot分析 将SDS-PAGE凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上，与兔抗His标签多克隆抗体反应后，转化重组质粒菌株在约25 kDa处出现清晰的反应条带(中插彩版图3)，表明Cap基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了成功表达。

图3 重组Cap蛋白的Western Blot分析Fig.3 Western Blot analysis of recombinant Cap protein M：蛋白质marker Ⅱ；1：转化重组质粒菌株的表达产物；2：转化空质粒菌株的表达产物M:Protein marker Ⅱ;1:Expression products of the strain with the recombinant expression plasmid;2:Expression products of the strain with the blank plasmid

2.4 蛋白酶解肽段的LC-MS/MS分析 应用MaxQuant(1.6.2.10)软件对重组蛋白的LC-MS/MS检测数据(图4A)进行分析，其氨基酸序列与参考毒株PCV3-US/SD2016(GenBank登录号：APC65716)的Cap蛋白序列(不含核定位序列)的一致性为88.4%(152/172 aa)(图4B)，证明表达的蛋白为PCV3-Cap蛋白。

图4 Cap蛋白的LC-MS/MS检测Fig.4 Detection of Cap protein by LC-MS/MSA：总离子流色谱图；B：鉴定的氨基酸序列(加下划线的序列与参考序列一致)A:Total ion chromatogram;B:Identified amino acid sequence(the underlined sequences are the same as those of the reference)

2.5 蛋白的抗原表位 如表1所示，参考毒株的Cap蛋白共有6个抗原表位，其中1个表位(24VRRKLFIR31)位于N端核定位信号区域内。除不含核定位信号区域的1个表位外，表达的Cap蛋白所含的5个抗原表位与参考序列的完全一致。

表1 表达蛋白与PCV3-Cap蛋白参考序列之间的预测抗原表位比较Table 1 Comparison of predicted antigenic determinants in the expressed protein with those in PCV3-Cap reference sequence

2.6 蛋白的抗原活性 以表达的Cap蛋白第3次免疫BALB/c小鼠后10 d，用ELISA在免疫小鼠血清中均检测到了Cap蛋白特异性抗体，抗体效价≥1∶12 800(图5)。该结果表明，表达的重组蛋白具有良好的免疫活性。

图5 PCV3-Cap蛋白免疫小鼠的血清特异性ELISA抗体水平Fig.5 Serum specific ELISA antibody level of mice immunized with PCV3-Cap proteinNegative：非免疫对照小鼠的血清混合物(n=3)Negative:The pools of serum from non-immunized control mice(n=3)

3 讨论

Cap蛋白是解析PCV致病机制及PCV疫苗和检测技术研究的关键靶蛋白[10]，基于真核或原核表达系统表达的PCV2-Cap蛋白制成的亚单位疫苗和研制的检测技术均已经广泛应用PCV2的免疫防控和检测中。PCV3具有与PCV2类似的基因组结构，初步研究发现，PCV3-Cap蛋白在体外可以抑制I型干扰素反应[12]，在Cap蛋白上鉴定出3个线性B细胞表位(57NKPWH61、140KHSRYFT146和161QSLFFF166)[13]。为深入解析Cap蛋白的抗原表位与免疫功能，为相关疫苗和检测技术研究提供科学依据，同时考虑到原核表达系统操作简单、蛋白表达量高、成本低，更适合将来开发应用，本试验应用E.coli表达系统体外表达了重组Cap蛋白。

由于Cap蛋白N端的核定位信号序列含有丰富的精氨酸残基和大肠杆菌稀有密码子，致使利用原核表达系统无法表达完整的Cap蛋白或蛋白表达量过低[14]。因此，表达Cap蛋白时，需要对N端核定位信号序列进行密码子优化，或者截掉该区域[15]。鉴于预测PCV3-Cap蛋白的抗原表位主要分布在核定位序列之后的区域，本试验在构建表达载体时，采取了缺失核定位信号序列的方案。此试验设计与文献[16]报道的相似。由于目前没有商品化的PCV3特异性抗体用于Cap蛋白的鉴定，所以很多报道都是用抗His标签抗体间接证明目的蛋白得到了表达[15]，但是无法真正了解表达蛋白的氨基酸序列，故本试验除了用抗His标签抗体证明目的蛋白表达外，进一步应用LX-MS/MS技术分析了表达蛋白的氨基酸序列，证明目的蛋白的氨基酸序列与推导的PCV3 Cap蛋白参考序列高度一致，抗原表位完全吻合，并通过动物免疫试验证明表达的蛋白具有良好的免疫原性。但本试验预测的抗原表位与文献[13]报道的抗原表位不完全相符，对此需要进一步试验证明。