兔口腔鳞状细胞癌的临床诊断

范志宇，陈萌萌，仇汝龙，胡 波，魏后军，宋艳华，朱伟峰，徐为中，薛家宾，王 芳

(江苏省农业科学院兽医研究所 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏 南京 210014)

2018年，安徽某兔场不间断发现死亡毛兔口腔中有增生物、个体消瘦、颜面变形等情况。本试验对临床患病兔进行剖检，通过病理组织石蜡切片方法，对兔口腔增生物进行病理学检查，并进行了乳头瘤病毒的检测。综合剖检、病理切片和病原检测结果，最终诊断病兔患口腔鳞状细胞癌。本试验首次报道了家兔口腔鳞状细胞癌，为相关疾病的诊断和研究提供了科学依据。

1 疾病调查

通过问询家兔养殖场场主及养殖人员得知，在本养殖场及周边5个兔养殖场均出现口腔肿瘤发病情况，发病兔均为毛兔，暂未发现有肉兔和獭兔发生该病，并且该病集中发生于兔毛长且有卷曲的毛兔，发病率在20%以上，相同养毛期内兔毛短而直的毛兔未见发病。患病毛兔年龄偏大，均为2岁以上。

2 临床症状

通过问询得知，当发现毛兔出现口腔问题时，肿瘤已经相对较大，患病兔出现面部变形，精神沉郁，体温正常，口腔增生物严重影响动物正常采食，采食量减少，吞咽困难，流涎，食欲减退，体重减轻，逐渐消瘦衰竭死亡。

3 大体剖检病变

对濒死的患兔安乐死后剖检，结果显示，患兔发育完全，体形偏瘦；天然孔(口、鼻、肛门)黏膜呈粉红色，毛细血管充盈时间正常；口腔增生物呈浸润性生长致使面部肿胀、变形，口腔内部皮肤多有坏死与出血；触诊增生物质地较硬，有结缔组织将其分为多叶，最大的大小为2.5 cm×2 cm×1 cm，切面灰白色。经仔细检查，头部及身体其他部位未发现增生物。

4 病原检测

设计PCR引物扩增不同的乳头瘤病毒DNA片段，E3-F:5′-ATGATAGGCAGAACTCCTAAG-3′和E3-R：5′-CAGTTACAACACTCCGGGCAC-3′，扩增病毒基因片段E3，大小为 285 bp；E4-F:5′-ATGAGCCATGGACATTGC-3′和E4-R：5′-TTATAAGCTCGCGAAG-CC-3′，扩增病毒基因片段E4，大小为639 bp；E5-F：5′-ATGGGCTTTAGTGACGTGTA-3′和E5-R：5′-CTA-GTCGACCCCCAGAACC-3′，扩增病毒基因片段E5，大小为639 bp；P-450-F:5′-CTGGCAGAGCGCTTTG-GACCG-3′和450-R:5′-CTTGTCCTTAAACTCCCGCAAAG-3′，扩增兔细胞色素P-450，大小为159 bp，作为有效扩增的对照。反应体系：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，上下游引物各(10 μmol/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，抽提物5 μL，加水补至25 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min，然后进行32次循环(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃ 5 min，4 ℃保温。

提取增生组织RNA，反转录为cDNA，以此为模板，利用针对乳头瘤病毒的特异性引物进行PCR扩增后，经过琼脂糖凝胶电泳，结果为阴性(图1)，结合临床初步判断该病不是乳头瘤病毒感染所致。

图1 PCR扩增乳头瘤病毒不同DNA片段M：DNA marker(DL 2 000)；1～4:以增生物活检DNA 为模板分别扩增病毒核酸E3、E4、E5和兔细胞色素P450；5～8：以乳头瘤病毒DNA为模板分别扩增病毒E3、E4、E5和兔细胞色素P450

5 病理切片观察

对患病家兔耳缘静脉注射空气安乐死后，在兔口腔患部进行手术去除增生物，观察其形态，并取增生物进行常规病理组织学制片，石蜡包埋,切片厚 5 μm，H.E.染色，采集数码图像。结果显示，该增生物为鳞状细胞癌，癌组织浸润性生长，形成大小不等，形状不同的癌细胞团块，即癌巢，较大的癌巢中心部分发生角化，即癌珠；肿瘤细胞形态和组织结构出现明显异型性，即瘤细胞排列紊乱，瘤细胞及其核呈多形性。病变中可见少量明显的角化不全性角质囊肿(中插彩版图2A黄色箭头)；也可见未非角化型鳞状细胞癌小叶，周围上皮细胞呈栅栏状排列(中插彩版图2B黑色箭头)，中央呈透明细胞表现(中插彩版图2B红色箭头)；可见嗜碱性核内包涵体。

图2 兔口腔肿瘤H.E.染色切片观察 (200 ×)A：角化型鳞状细胞癌小叶；黄色箭头：癌巢中可见少量角质化不全性角质囊肿；B：非角化型鳞状细胞癌小叶；黑色箭头：周围上皮细胞呈栅栏状排列；红色箭头：癌小叶中央呈透明细胞表现

6 讨论

口腔肿瘤即为口腔颌面部肿瘤，有恶性和良性之分[1]。最常见的口腔恶性肿瘤为鳞状上皮细胞癌，占口腔恶性肿瘤的90%，其作为全身恶性肿瘤中常见的肿瘤类型，不仅会造成面部畸形，同时也由于肿瘤位置的血液循环以及淋巴回流丰富，因此具有较高的转移率[2-3]。在犬猫临床中口腔肿瘤发生的概率较高，占所有肿瘤的6%[4-6]。

随着家兔养殖技术的发展，一些品种的家兔(如：曾祖代或祖代种兔、毛兔、宠物兔等)饲养时间也逐步延长，可能发生与其他动物类似的肿瘤疾病的概率相对增加。研究显示，家兔肿瘤疾病发病率为0.5%～2.7%，常见的家兔肿瘤包括子宫腺癌、乳腺肿瘤和皮肤瘤等[7]，口腔肿瘤也有被报道，但发病率似乎较低，多为病毒感染引起的良性肿瘤[1,8-9]，国内外尚未见关于兔恶性口腔肿瘤-鳞状细胞癌的报道[7,10-12]。家兔肿瘤的发病率受年龄因素的影响很大，由于绝大多数商品兔和实验兔都是在2岁以前就被利用，处于老年期的家兔才是肿瘤的易发年龄，所以一般兔场很少见家兔肿瘤的发生。在实际生产中，毛兔养殖时间通常在2年以上，由于毛兔养殖时间周期长，发生肿瘤的概率也大大增加。

本试验首次报道了兔口腔鳞状细胞癌。本试验结果提高了人们对动物肿瘤病，特别是兔口腔恶性肿瘤的认识，为未来相关疾病的诊断和研究提供了科学依据。然而，本病产生的具体原因不明，推测可能与饮食、微生物、遗传因素及品种等因素有关[13-14]。在调研中发现，养殖户在选育过程中更偏爱卷毛的兔子，选育的卷毛兔更容易得口腔恶性肿瘤，这可能与卷毛兔自身存在基因缺陷有关。在江苏盐城等地调研中也发现类似病例，均为毛兔发病，在养毛期相同的情况下，易发病兔的被毛比正常毛兔被毛长，且前端易卷曲，也进一步证实了该病的发生和遗传因素可能有较大关联。

目前，口腔肿瘤的临床治疗中通常采取包括手术、化学药物、放射、加热治疗以及营养治疗等具有针对性的治疗方式，并在综合治疗原则的基础上，将各个治疗方法进行有效的联合[2]。由于鳞状细胞癌的具体病因还不清楚，暂时还没有行之有效的预防手段，在本试验中，考虑到经济效益的因素，为了预防肿瘤的发生以及减小肿瘤疾病对家兔的影响，建议养殖场加强饲养管理，在选育过程中，选择没有肿瘤的母兔进行繁殖，如遇到有肿瘤的母兔应及时停止繁育并淘汰。对于宠物兔而言，由于大部分品种有毛兔的遗传背景，且饲养时间相对较长，参考犬、猫等宠物的相关报道[4,15]，建议在没有转移病灶的情况下，第一时间手术切除全部肿瘤，这样对治愈该病可起到积极作用，也可在确诊后进行安乐死。