吕梁黑山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的快速发现及去除

吴苏君，李 希，王 曦

(山西农业大学动物科学学院，山西 太原 030032)

细胞体外增殖技术被称为细胞培养，广泛应用于科研、教学、临床试验、制备生物制品等领域，其中污染控制是关键。能导致细胞污染的微生物很多，最为常见的是支原体[1]。由于缺乏细胞壁的支撑，支原体可变形通过0.22 μm滤膜，常用抗生素如青霉素和链霉素对其去除效果不佳[2]。世界范围内使用中的细胞系支原体污染发生率为30%～60%[3-5]，国内来源的细胞株系支原体污染发生率高达60%[6]。支原体污染初期，细胞形态变化不甚明显，支原体滴度随时间延长逐渐升高，最高可达109个/mL。污染发生后期，支原体改变细胞DNA/RNA及蛋白的表达，导致其变形、死亡[7]。因此，在污染初期尽快进行支原体检测、去除尤为重要。目前检测及去除支原体污染的方法很多。吕梁黑山羊作为山西省地方优良品种，具有珍贵的生物种用价值[8]。本试验采取吕梁黑山羊耳缘组织培养成纤维细胞，结合运用高倍显微镜直接观察法和DNA荧光染色法，快速发现细胞培养过程中的支原体污染，利用支原体抗生素Plasmocin将其去除，检测去除效果，进而构建稳定的细胞培养体系，为后续探究吕梁黑山羊种质资源的利用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 吕梁黑山羊(0～3月龄)耳缘组织，采自山西省农业科学院畜牧兽医研究所克隆基地试验羊场；胎牛血清FBS，购自Hyclone公司；DMEM，购自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、Hoechst 33342，均购自Sigma公司；PlasmocinTMtreatment，购自InvivoGen公司；细胞cDNA提取试剂盒、DL2 000 DNA Marker，均购自TIANGEN公司；RT-PCR试剂盒，购自TaKaRa公司；其他试剂均为国产分析纯。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏 选择0～3月龄的吕梁黑山羊，获取耳尖皮肤组织(1 cm2)进行原代培养。每隔2 d更换培养液，5～7 d后观察组织块周围有无细胞迁出，待原代培养的单层细胞汇合度达到80%时，进行传代培养或冷冻保存。细胞复苏时，观察细胞活力状态。

1.2.2 支原体污染检测 高倍显微镜直接观察：疑为支原体污染的细胞及对照组细胞在高倍显微镜下直接观察，根据其形态学变化，对比判断有无污染。DNA荧光染色法：疑为支原体污染的待测细胞及对照组细胞在室温下加入浓度为5 μg/mL的Hoechst 33342染色30 min，DPBS洗涤3次，荧光显微镜紫外光下观察，判断有无支原体污染。

1.2.3 支原体污染去除 疑为支原体污染的待测细胞更换添加25 μg/mL Plasmocin的细胞培养液，正常传代培养，连续药物处理14 d。

1.2.4 药物处理后支原体污染检测 用高倍显微镜直接观察法和DNA荧光染色法分别对比药物处理试验组、对照组，方法同上。PCR法检测：根据16S rRNA支原体种属特异性区域设计引物(上游引物：5′-CACAATGGGCGAAAGCCTGAT-3′；下游引物：5′-CATCGTTTACGGCGTGGACTACC-3′)，产物长度为453 bp。使用cDNA提取试剂盒提取药物处理试验组、对照组细胞的基因组cDNA。以其为模板进行RT-PCR反应，反应体系(总体积20 μL)：上下游引物各0.8 μL、ExTap酶10 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 6 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察。

1.2.5 细胞生长曲线的测定 Plasmocin连续处理14 d的试验组细胞汇合度达到80%时，消化重悬细胞，以1×104个/孔接种至24孔板中培养。每24 h计数细胞，每次计数重复3次，求平均值，连续计数7 d后，根据时间和细胞密度绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 细胞原代、传代培养及冻存、复苏培养 通过组织块贴壁培养法成功分离出吕梁黑山羊耳缘组织成纤维细胞。培养10 d左右能分辨出组织块周围有梭形且边缘立体的成纤维细胞。形态学观察可见细胞主要呈梭形、多角形或不规则形，细胞排列分散，见封三彩版图1A；细胞传代后生长状态良好，形态正常，见封三彩版图1B；细胞复苏后活力达到80%，生长状态良好，形态正常，见封三彩版图1C。

图1 吕梁黑山羊成纤维细胞培养Fig.1 Lyuliang black goat fibroblast cultureA：细胞原代培养(40×)；B：细胞传代培养(200×)；C：细胞复苏培养(200×)A:Cell primary culture(40×)；B:Cell passage culture(200×)；C:Cell resuscitation culture(200×)

2.2 高倍显微镜直接观察 疑为支原体污染的待测细胞折光性差，扁平分散，培养皿底部有黑点，见图2A；对照组细胞大多呈梭形，边缘立体，培养皿底部未见明显黑点，见图2B。但肉眼观察比较细胞形态学变化并不显著。

图2 显微镜下观察吕梁黑山羊成纤维细胞(200×)Fig.2 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原体污染的细胞；B：对照组A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells；B:Control group

2.3 DNA荧光染色法 疑为支原体污染的待测细胞在细胞核外可见散在荧光，推测被支原体污染，见封三彩版图3A；对照组细胞核区可见边缘整齐清晰的荧光，核外无荧光，见封三彩版图3B。

图3 荧光显微镜下观察吕梁黑山羊成纤维细胞(200×)Fig.3 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原体污染的细胞，核外有散在荧光(箭头)；B：对照组A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells，had scattered fluorescence outside the nucleus(Arrow)；B:Control group

2.4 支原体污染药物处理后检测 使用Plasmocin药物连续处理14 d后，高倍显微镜下肉眼观察细胞形态恢复立体，生长均匀，培养皿底部黑点明显减少，见封三彩版图4A；对照组见封三彩版图4B。荧光试剂Hoechst 33342染色观察DNA，药物处理试验组和对照组细胞均只见胞核，核外未见散在荧光，见封三彩版图4C、4D。PCR 检测发现，药物处理试验组和对照组细胞条带均呈阴性，见封三彩版图4E。

图4 药物处理吕梁黑山羊成纤维细胞后支原体检测结果Fig.4 Detection results of Mycoplasma after drug treatment with the Lyuliang black goat fibroblasA：显微镜下观察药物处理组细胞(200×)；B：显微镜下观察对照组细胞(200×)；C：荧光显微镜下观察药物处理组细胞(200×)；D：荧光显微镜下观察对照组细胞(200×)；E：支原体PCR检测(M：DL2 000相对分子质量标准；1：药物处理试验组；2：对照组)A:Observe the drug treatment experimental group under the microscope(200×)；B:Observe the control group under the microscope(200×)；C:Observe the drug treatment experimental group under the fluorescence microscope(200×)；D:Observe the control group under the fluorescence microscope(200×)；E:PCR detection of Mycoplasma(M:DL2 000 marker；1:Drug treatment experimental group；2:Control group)

2.5 细胞生长曲线的绘制 用Plasmocin处理细胞14 d，根据细胞计数结果，以单位细胞密度为纵坐标、培养时间为横坐标绘制生长曲线。结果如图5所示，细胞生长曲线呈S型分布，1～3 d细胞处于适应期，生长缓慢；3～6 d细胞处于指数生长期，生长旺盛；6～7 d细胞处于平台期。

图5 吕梁黑山羊成纤维细胞生长曲线Fig.5 The growth curve of the Lyuliang black goat fibroblast

3 讨论

支原体污染在细胞培养过程中发生率很高，细胞被支原体污染后，其功能及代谢均受到影响。支原体可以吸附到细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；还可以进入宿主细胞内，消耗细胞中的营养物质，造成细胞生长缓慢甚至停止；使pH降低，影响细胞代谢；引起细胞染色体畸变或数量变化[9-14]。此外，支原体代谢产物还能诱导宿主细胞发生免疫抑制和免疫损伤[15]、引起胞膜相变运动等[16-17]。值得注意的是，支原体在与宿主细胞的长期共存中形成了可逃避自噬的胞内生存机制[18]，支原体的滴度将随着污染时间的延长而逐渐升高[19]。因此，在支原体污染早期就对支原体进行去除对保护细胞尤为重要。

目前，检测细胞培养液中支原体的方法有很多种，如显微镜观察法、DNA荧光染色法、电镜、ELISA法、支原体直接培养法、聚合酶链反应(PCR)及荧光定量PCR等[20-23]，但均存在一些缺点。现从试验周期、优缺点、价格、适用范围等方面将常用的4种支原体污染检测方法的进行比较[20]，见表1。

表1 4种常用支原体污染检测方法比较Table 1 Comparison of four common detection methods of Mycoplasma contamination

高倍显微镜直接观察法：支原体污染早期，细胞生长变慢，立体性差，细胞形态变化不甚显著，细胞间有微小黑点，需在高倍显微镜下仔细观察；随着污染时间延长，显微镜下可观察到细胞生长分散，大部分细胞开始出现空泡，呈现“流沙状”脱落、崩解[14]，培养皿底部有明显黑点[20]，该方法在怀疑污染时具有一定鉴别作用。有研究指出，支原体污染早期细胞形态变化不显著，该方法假阳性和假阴性率较高。本试验发现，在怀疑污染发生的情况下筛查细胞，能观察到细胞形态变化及细胞间的黑点。但该方法不能作为常规检测方法，只能作为鉴别方法。DNA荧光染色法：荧光染料Hoechst 33342能选择性结合DNA小沟，支原体DNA和细胞DNA均会被染色[1]。利用该方法能在荧光显微镜下直接观察到支原体，即支原体除胞核有荧光外，核外还可看到许多分散的荧光小点[11]。但细胞碎片染色后容易出现假阳性，或支原体污染非常轻微时容易出现假阴性，一般需要无支原体污染的细胞作为对照[13]。PCR检测方法可快速检测细胞培养物和生物制品、血清等生物材料中的支原体污染[22]，具有较高的灵敏度，特异性较强；但由于支原体的多样性，有种、属间交叉反应[18]，支原体与衣原体具有同源性[24]，检测结果可能出现假阳性，所以在选择靶序列及引物方面必需谨慎。上述方法各有特点，仅用单一方法检测存在局限性。鉴于高倍显微镜为细胞试验中必备仪器，Hoechst 33342为常备试剂，所以在细胞培养过程中发现培养液在更换后短时间内颜色变化(颜色呈橙色或黄色)，初步怀疑为支原体污染时，可使用高倍显微镜直接观察法和DNA荧光染色法结合检测，能在1 h内发现支原体污染，据此快速进行支原体污染去除，将污染控制在数量及影响较少的早期，对细胞损伤较小，适合于珍贵的细胞。

细胞被支原体污染后，彻底清除非常困难。若污染细胞具有可替代性，应丢弃；若污染细胞来源有限、难以替代，就需要采取措施去除支原体。常见去除方法有克隆法、裸鼠过继法、加热法和药物处理法等[19]，实验室多采用支原体抗生素Plasmocin去除支原体污染[25]。支原体抗生素Plasmocin能在不影响细胞代谢的提前下可阻止复制叉形成，阻断DNA复制；干预核糖体的翻译，阻止蛋白合成，是目前最理想的去除支原体药物[18-19]，但其价格昂贵，限制了它的广泛应用[26]。需要注意的是，细胞培养作为无菌技术，过程中不可滥用抗生素，应仅在污染发生时短期使用，防止微生物混乱。应加强预防和常规检测力度，这与有些研究中提到使用低剂量抗生素预防支原体污染的理念不同。

本试验的不足之处是采用了准确率较低的2种检测方法来检测支原体污染，存在假阳性的可能。原因在于首次发现细胞疑似遭受支原体污染时，需尽快确定是否为支原体污染，并根据检测结果使用支原体抗生素Plasmocin对细胞进行处理，以减少支原体对细胞的伤害。为了提高检测结果的准确性，在Plasmocin处理期后，引入PCR法。综合使用3种 方法对清除效果进行检测，发现经Plasmocin处理后，细胞中支原体已被完全去除。邢龙彬等、张丹丹等研究发现，不同细胞对Plasmocin的敏感度和耐受性不同，细胞中支原体在被去除后很容易重复感染，需要继续给药[19,25]。本试验在细胞用Plasmocin处理14 d后，绘制细胞生长曲线，发现细胞的生长和增殖速度均恢复正常，未复污染。说明吕梁黑山羊成纤维细胞仅需支原体抗生素Plasmocin处理14 d 即可去除支原体早期污染，未复感，不需另外给药。推测在发现污染早期对支原体进行去除可能效果更好，不易复感。本试验在细胞被支原体污染早期快速发现并及时对其进行处理，建立了细胞污染处理快速反应机制，在细胞培养实际工作中具有很高操作性，实用性强，具有借鉴价值。

预防重于治理，在细胞培养过程中，要时刻警惕支原体及其他污染，制定严格规范的细胞培养间日常管理消毒制度，定期对细胞、试剂、耗材、仪器进行污染检测，规范试验操作和纪录流程，把污染的可能性降到最低，提高试验结果的稳定性和可靠性。