鸡传染性支气管炎病毒核酸检测专用标准物质的制备

黄袁慧,王乃迪，陈玉红，高晓艺,3，刘 洋，顾小雪，杨 林，辛盛鹏，王传彬,刘玉良

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 大兴 102618；2.广西大学动物科技学院，广西 南宁 530005；3.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038)

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科冠状病毒属中的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的发生于鸡只的一种急性、高度接触性疾病，主要表现为呼吸道症状[1]。IB是发病率和死亡率均较高的一种重要疫病，该病不仅会导致发病鸡死亡，还会使发病鸡的生产性能下降，对养鸡业的健康发展危害巨大[2]。IBV血清型多，病毒极易发生变异，不同毒株之间的交叉保护力很弱。研究发现，IBV的基因型共有9种：QX型(又称LX4型)、CK/CH/LSC/99I型、J2型、4/91型、JP型、TW型、Italy02型、Tc07-2型和Mass型。我国IBV流行株的基因型是在QX型、LSC/99I型、793/B型、LDL/97I型和TWⅠ型的基础上经过同源重组而产生的[3]。IBV基因型众多，引起的临床症状和病理变化差异较大，因此，根据临床症状只能做出初步诊断，确诊则需要实验室检测。目前，检测IBV的方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法、分子生物学方法等[3-4]。RT-PCR方法具有简便、快速以及敏感性和特异性强等优点[5]，国家标准《鸡传染性支气管炎诊断技术》(GB/T 23197—2008)中也描述了该检测方法。但是，目前我国尚缺乏相应的IBV核酸标准物质，因此，无法评价检测试剂的质量和检测方法的可靠性以及验证检测能力等。基于此，本课题组申报了国家标准物质研制计划并获得批准立项，继而开展了IBV核酸检测专用标准物质研制工作，所研制的标准物质有望解决在该病毒检测中存在的实际问题。

1 材料与方法

1.1 毒株 IBV M41株冻干病毒，购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要仪器和试剂 KingFisher 96自动化核酸提取仪、Steril GARD Advance生物安全柜、ABI Veriti型PCR仪、UVP凝胶成像分析系统。磁珠法病毒RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；GoTaq®Green Master Mix，购自Promega公司；引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病毒的繁殖和鉴定 IBV M41株冻干病毒用1 mL无菌PBS完全复溶，接种9～11日龄SPF鸡胚，孵育和收获病毒。按照国家标准《鸡传染性支气管炎诊断技术》(GB/T 23197—2008)所述方法，提取上述尿囊液中IBV基因组RNA，用标准中上游引物3′s(5′-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3′)和下游引物3′x(5′-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3′)进行扩增，同时扩增SPF鸡胚尿囊液作为阴性对照。将扩增产物纯化后连接T载体进行测序验证。

1.4 标准物质的制备 将上述病毒进行无菌和外源病毒检验，合格后进行分装，于-70 ℃保存备用。将IBV逐代扩增和检验，将扩增3代繁殖的M41株IBV灭活，将灭活后的病毒接种10日龄SPF鸡胚后，根据鸡胚死亡情况以及收集鸡胚尿囊液进行RT-PCR扩增的结果，判断灭活效果，同时扩增灭活前的IBV和SPF鸡胚尿囊液作为阳性和阴性对照。将扩繁和鉴定并已灭活的病毒与冻干保护剂按适当比例充分混合，分装。置于-80 ℃冰箱预冻2 h后，迅速移到冻干机中冻干，制备标准物质，然后置于-80 ℃冰箱中冻存。

1.5 标准物质的检验 (1)物理性状检验：肉眼检验所制备的标准物质的外观物理性状。(2)无菌检验：取所制备的标准物质复溶后在无抗生素的LB平板上涂板，培养后观察有无菌落生长。(3)支原体检验：取复溶的标准物质，用支原体检测试剂盒进行支原体检测。(4)外源病毒检验：标准物质复溶后，提取核酸，检测是否含有禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)、小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、马立克氏病病毒(Marek’s virus,MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、网状内皮组织增殖征病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、鸡产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus-76,EDSV-76)、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal virus,IBDV)，同时设立各病毒阳性对照和阴性对照(SPF鸡胚尿囊液)。(5)病毒灭活检验：将制备的标准物质复溶后，接种9～11日龄SPF鸡胚，连续传3代，观察各代次鸡胚是否死亡，同时用国家标准(GB/T 23197—2008)中RT-PCR方法进行检测。

1.6 均匀性评估 在分装保存的IBV核酸检测专用核酸标准物质中随机抽取 15管样品进行检测，每管重复3次。检测方法为本标准物质制备时所用的标定方法，采用单因素方差分析对标准物品进行均匀性分析。

1.7 稳定性监测 对所制备的标准物质的短期稳定性监测是测试模拟运输条件下标准物质的稳定性，长期稳定性则是测试标准物质在长期贮存条件下的稳定性。(1)短期稳定性监测：将标准物质在4 ℃环境下存放7 d和14 d；在25 ℃环境下存放 1、3 d和5 d；在37 ℃环境下存放1 d和3 d。然后，与存放在-80 ℃ 环境中的标准物质同时进行荧光RT-PCR检测，检测结果分别进行t检验分析。(2)长期稳定性监测：将标准物质在(-20±5)℃条件下贮存，分别在第1、3、6、9、12个月抽取5瓶进行荧光RT-PCR检测，每管样品重复检测2次，计算平均值，进行稳定性分析。

1.8 合作定值 根据M41株IBVN基因保守区域基因序列，应用Primer Primier 5.0软件设计引物，扩增N基因ORF序列后连接到pGEM Teasy载体并鉴定。利用公式拷贝数(copies/μL)=[(ng/μL×10-9)×(6.02×1023)]÷(碱基数×660)，计算重组质粒pGEM Teasy-IBV-N拷贝数。以拷贝数为x轴，以荧光RT-PCR中的Ct平均值作为y轴，绘制散点图并拟合直线。根据IBV M41株及参考毒株保守序列，设计合成1对引物和TaqMan探针，经过优化，建立合作定值方法。该方法反应体系：2×Quant One Step Probe RT-qPCR Master Mix 10 μL,HotmasterTaqpolymerase(2.5 U/μL)0.8 μL，上下游引物混合物(10 pmol/μL)1.6 μL,IBV-268-prob探针(10 pmol/μL)0.8 μL，RNasin(40 U/μL)0.3 μL，Quant RTase 0.3 μL，模板200 ng,加灭菌蒸馏水补充到20 μL；荧光RT-PCR反应条件:42 ℃ 45 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；40个循环。选择9家具有病毒核酸检测资质并能开展相关工作的权威实验室对所制备的标准物质进行合作定值，每家检测2管，每管重复检测2次，采用上述所建立的荧光RT-PCR方法进行定值。

2 结果

2.1 原料的制备和鉴定 提取接种的尿囊液中IBV基因组RNA，用国家标准(GB/T 23197—2008)中RT-PCR方法进行扩增，结果可扩增出大小约为290 bp的特异性条带(图1)。测序结果显示，扩增片段序列与已发表的IBV序列(GenBank：MK937830.1)完全一致(结果略)，表明所获得的原料为IBV。

图1 RT-PCR鉴定IBV M41株Fig.1 Identification of IBV M41 strain by RT-PCR1：阴性对照；2～5：IBV M41株(不同鸡胚繁殖的病毒)；M：DNA分子量标准(DL2 000)1:Negative control;2-5:IBV M41 strain from different embryonated SPF chicken eggs;M:Marker(DL2 000)

所制备的IBV核酸检测专用标准物质外观呈白色块状固体，无气泡。如中插彩版图2所示。

图2 IBV核酸检测用标准物质成品Fig.2 Reference material for nucleic acid detection of IBV

2.2 标准物质检验 将所制备的标准物质经培养检测，结果无菌落生长；用支原体检测试剂盒检测，结果无扩增条带(图3)，表明该标准物质无支原体污染。用PCR、RT-PCR、荧光PCR和荧光RT-PCR方法扩增上述其他常见禽病病原，结果均无特异性扩增条带或扩增曲线，表明该标准物质纯净，无外源病毒干扰。将标准物质在鸡胚上连续传3代，结果未发现鸡胚死亡，此外，用上述荧光RT-PCR方法进行检测，结果均为阴性，说明该标准物质已被灭活。

图3 支原体RT-PCR检测结果Fig.3 The results of RT-PCR detection of MycoplasmaM：DNA分子量标准(DL2 000)；1：支原体阳性对照；2：IBV标准物质M:Marker(DL2 000);1:Mycoplasma positive control;2:Reference material for IBV

2.3 均匀性评估 采用随机顺序重复测量的方法，将标准物质顺序编码，随机抽取15瓶标准物质，每管样品检测3次，采用单因素方差分析方法对标准物品进行均匀性分析。结果显示，荧光RT-PCR检测结果均为IBV阳性。根据所得的Ct值以及测量次数分别计算出数据之和、平均数以及方差，最后采用单因素方差分析方法对标准物质进行均匀性分析，根据查表获得临界值的F值，计算方差均方α值，结果为F

表1 方差分析Table 1 Variance analysis

2.4 稳定性评估

2.4.1 短期稳定性评估 取适量的标准物质在4、25 ℃ 和 37 ℃条件下，分别存放不同长度时间，然后分别与存放在-80 ℃环境中的标准物质的检测结果进行t检验统计分析。根据对照组在-80 ℃条件下标准物质荧光RT-PCR检测的Ct值结果，计算出均值及标准差。结果如表2～4所示，该标准物质在4、25 ℃和 37 ℃环境中可稳定保存60、7 d和3 d。

表2 4 ℃条件下稳定性监测结果Table 2 Stability monitoring results of reference material stored at 4 ℃

2.4.2 长期稳定性评估 在第1、3、6、9、12个月，每次抽取5管标准物质，每管样品重复检测2次，计算均值，进行稳定性分析。结果如表5所示，该标准物质稳定，因此，本标准物质在-20 ℃环境下可稳定12个月。

表4 37 ℃条件下稳定性监测结果Table 4 Stability monitoring results of reference material stored at 37 ℃

表5 在-20 ℃保存条件下长期稳定性检测结果Table 5 Stability monitoring results after long-term preservation at -20 ℃

2.5 标准物质的定值 通过计算，pGEM Teasy-IBV-N重组质粒拷贝数为7.2×107拷贝/μL。以拷贝数为x轴，平均值Ct为y轴，绘制散点图并拟合直线(如中插彩版图4)。结果显示，所建立的荧光定量RT-PCR方法的拟合直线的线性关系良好，标准曲线为y=-3.427x+37.81，R2达0.999，斜率为-3.427，扩增效率为95.79%。

图4 IBV检测的荧光RT-PCR方法标准曲线Fig.4 Standard curve of the real-time RT-PCR for IBV detection

将所制备的标准物质冷链寄送到9家实验室，每家2管，每管重复检测2次，由2名实验员同时进行试验。检测结果显示均为IBV阳性(表6)。合作定值中，各实验室反馈的荧光RT-PCR的Ct值，在95%置信区间下，计算该标准物质的平均Ct值为21.84±1.70，即为该标准物质的参考值，可用于质量控制和稳定性监测的参考值。

表6 合作定值结果(Ct值)Table 6 Results of cooperating detection(Ct values)

3 讨论

鸡传染性支气管炎是由支气管炎病毒感染所引起的一种重要禽传染病，在世界范围内广泛流行，一年四季都可发生，而且，该病目前没有特效的治疗药物，只能依靠有效的诊断、监测、疫苗免疫以及加强生物安全管理等综合措施来防控[6-7]。通过临床表现和剖检后观察病理变化可对该病初步诊断，但确诊需借助实验室检测，最常用的方法为血清学试验和分子生物学检测技术[4-6]。血清学试验主要有病毒中和试验、荧光抗体试验、琼脂扩散试验、间接免疫荧光试验等。而分子生物学诊断方法主要是常规RT-PCR和荧光RT-PCR方法[4,7]。

RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法操作简单、快速、方便，特异性和敏感性高。但是，由于不同实验室间在检测试剂、仪器设备、检测人员和试验操作技能水平等诸多方面存有差异，不同的实验室之间的检测结果难以进行比对和评价，因此，需要制备一种鸡传染性支气管炎病毒核酸检测专用标准物质，作为对照品，用于质量控制和比对评价，以实现不同实验室之间在检测水平上可比较和可溯源[8]。但是，目前在我国尚未见有鸡传染性支气管炎病毒核酸检测用标准物质研制的报道。

本研究中，依照标准物质研制的基本原则和要求[9]，成功研制出鸡传染性支气管炎病毒核酸检测专用标准物质，并对研制的标准物质进行了无菌检验、均匀性研究、稳定性评估及合作定值，结果表明，所制备的标准物质纯净均匀，稳定性好，无菌安全，无生物传染风险，易于保存，可作为鸡传染性支气管炎病毒核酸检测用的质控品，具有重要的实际应用价值。该标准物质的应用将有助于鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR和荧光RT-PCR检测方法的标准化，解决不同实验室、不同操作人员以及不同试验条件等差异下检测结果不能比对评价等问题，从而使得检测结果更加准确可靠，有利于提高实验室检测技术水平。