牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

王一新，周晓翠，高 超，赵 鹏，翟少华，冯 宇，李 阳

(1.山东农业大学动物医学院，山东 泰安 271018；2.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081；3.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；4.中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266114)

牛副结核病(Paratuberculosis)是由副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)引起的一种反刍动物慢性消化系统疾病[1]。该病呈世界性分布，副结核分枝杆菌可引起感染牛的产奶量下降、持续性消瘦和顽固性下痢，死亡率可达2%～10%，给我国养牛业带来了巨大经济损失。大量研究表明，人的克罗恩病与副结核分枝杆菌感染有关，可能是由于奶的巴氏消毒法不能够完全杀灭该菌，且研究中发现44%的奶制品中都检出副结核分枝杆菌为阳性。近年来该病逐渐引起世界各个国家的广泛关注[2-3]。鉴于副结核病对畜牧养殖业和公共卫生安全的潜在威胁，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疫病，我国亦将其列为二类动物性传染病。

尽早发现感染的动物并进行种群净化是防控牛副结核病的主要措施[4]。目前，常用于副结核分枝杆菌诊断的方法主要包括细菌的分离培养、皮下变态反应、IFN-γ释放试验、酶联免疫吸附试验及补体结合试验等[5-7]。然而，这些方法普遍存在操作困难、灵敏度低、敏感性差或检测周期长的缺点，难以满足临床诊断需要。因此，建立准确、高效、实用的副结核分枝杆菌检测技术，对于牛羊等反刍动物副结核病的早期诊断、提高我国畜牧业生产水平具有重要意义。

实时荧光定量PCR方法作为一种快速检测技术，已被广泛应用于兽医传染病的病原诊断中。它的原理是在普通PCR体系中加入荧光基团，通过监控荧光信号强度达到显示目的基因扩增动态的目的。与普通PCR方法相比，荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度强、可准确定量的优点。本试验建立了检测副结核分枝杆菌F57基因的SYBR Green I染料实时荧光定量PCR方法，并将其应用到临床样本的检测中，为牛副结核病的诊断和防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 副结核分枝杆菌标准菌株(C68604)，购自中国兽医药品监督所；灭活结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC 27294)、大肠杆菌O:157、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌等常见微生物核酸样品均由本课题组保存。

1.2 主要试剂与仪器 10×Taq反应缓冲液、dNTPs、PrimeSTAR®HS DNA 聚合酶、pMD18-T Vector及SYBR®PremixExTaq，均购自宝生物工程(大连)有限公司；凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒，均购自Omega公司；细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。7500型荧光定量PCR仪，购自ABI公司。

1.3 引物的设计 下载GenBank中牛副结核分枝杆菌F57基因序列，应用Primer 5.0 软件设计针对F57基因的特异性引物P1/P2。上游引物P1：5′-GTAGTGGGAGGCGTACCAGG-3′，下游引物P2：5′-ATTCGATCACGGACTAGACAGG-3′，预期扩增片段长度为224 bp。本试验所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 质粒标准品的制备 参照细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取副结核分枝杆菌标准菌株基因组DNA。以1 μg细菌DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系：10×Taq反应缓冲液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，50 μmol/L P1/P2引物各1 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶0.5 μL，补水至50 μL。PCR反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后复延伸10 min。反应结束后，将PCR产物回收纯化并与pMD18-T载体连接。挑取单菌落与含50 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中振荡培养12 h，使用质粒提取试剂盒提取质粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。鉴定正确的质粒作为标准品置于-20 ℃保存备用。

1.5 荧光定量PCR的建立和条件优化 以pMD-F57质粒标准品为模板，将上下游引物加入到反应体系中，于ABI 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。使用矩阵法对上下游引物进行优化，以得到最佳反应体系和反应条件。选用10、25 nmol/mL和50 nmol/mL的引物浓度进行筛选。

1.6 荧光定量PCR标准曲线的建立 将1×108拷贝/μL的重组质粒进行10倍梯度稀释至浓度范围1×108～1×101拷贝/μL，以其为模板，在最佳反应条件下同时扩增，每个稀释度设置3个重复，进行荧光定量PCR反应监测，绘制标准曲线。

1.7 荧光定量PCR的敏感性检测 将1×108拷贝/μL的质粒标准品进行10倍梯度稀释，分别以浓度范围1×108～1×101拷贝/μL的质粒为模板，进行荧光定量PCR反应，进行敏感性检测。同时以相同的质粒DNA为模板，进行常规PCR反应，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较两者敏感性的差异。

1.8 荧光定量PCR的特异性检测 分别以结核分枝杆菌标准菌株、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌等常见微生物DNA样品为模板，使用所建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，同时设置去离子水为阴性对照，检测所建立荧光定量PCR方法的特异性。

1.9 荧光定量PCR的重复性检测 对不同梯度浓度稀释的质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，每个梯度进行3次反应，通过组内的Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)评估所建立方法的重复性。另外，取3份感染了副结核分枝杆菌的牛的粪便样品，提取样本DNA，以此为模板进行荧光定量PCR检测，分析该方法的批内和批间重复性。批内重复：将3份DNA分别设立3个重复，在同一条件下同时检测，计算批内变异系数；批间重复：将3份DNA进行3次独立的荧光定量PCR检测，计算批间变异系数。

1.10 副结核分枝杆菌荧光定量PCR方法与普通PCR方法的比较 随机取50份奶牛养殖场收集的粪便样品，分别使用本试验建立的荧光定量PCR方法和普通PCR检测方法进行检测，比较2种检测方法的结果是否一致。

1.11 临床样品的检测 收集新疆维吾尔自治区规模化牛场中粪便样品85份，牛乳样品116份，利用建立的副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR方法进行病原检测。

2 结果

2.1 副结核分枝杆菌F57基因的PCR扩增和重组质粒的构建 以副结核分枝杆菌DNA为模板进行PCR扩增，将扩增到的目的片段克隆到pMD-18T载体中，构建重组质粒pMD-F57。使用EcoR I和SalI限制性内切酶进行酶切，结果显示，pMD-F57可被酶切为2 700 bp和200 bp左右的2个片段(图1)。测序结果进一步证实，扩增得到的F57基因片段与参考序列同源性为100%。使用质粒提取试剂盒提取质粒，分光光度计测定浓度为510 μg/mL，将标准品质粒置于-20 ℃保存备用。

图1 pMD-F57的双酶切电泳图Fig.1 Double enzyme digestion eletrophoresis of pMD-F57M：DL-2 000 DNA相对分子质量标准；1：双酶切pMD-F57M:DL-2 000 DNA marker;1:Double enzyme digestion of pMD-F57

2.2 实时荧光定量PCR的建立和条件优化 经反复探索，本试验所设定的最佳反应体系：2×SYBRPremixExTaq缓冲液10 μL，Rox reference dye II 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，模板2 μL，用去离子水补足总体积至20 μL，其中引物的最佳浓度为10 nmol/mL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s(收集荧光信号)，扩增40个循环。

2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 以10倍梯度浓度稀释的pMD-F57质粒标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得了检测副结核分枝杆菌的扩增曲线(中插彩版图2)和标准曲线(图3)。结果显示，当模板浓度为108～101拷贝/μL时，Ct值与标准品浓度具有良好的线性关系，R2值达到0.999，拷贝数对数值(x)与Ct值(y)的关系为y=-3.182x+31.938 4。对试验中每个梯度模板的Ct值进行统计分析。结果表明，8个稀释度标准质粒的Ct值变异系数(CV)为0.02%～0.86%。

图2 质粒标准品pMD-F57的扩增曲线Fig.2 Amplification curve of standard plasmid pMD-F571：1.0×108拷贝/μL；2：1.0×107拷贝/μL；3：1.0×106拷贝/μL；4：1.0×105拷贝/μL；5：1.0×104拷贝/μL；6：1.0×103拷贝/μL；7：1.0×102拷贝/μL；8：1.0×101拷贝/μL；9：空白对照1:1.0×108 copies/μL;2:1.0×107 copies/μL;3:1.0×106 copies/μL;4:1.0×105 copies/μL;5:1.0×104 copies/μL;6:1.0×103 copies/μL;7:1.0×102 copies/μL;8:1.0×101 copies/μL;9:Blank control

图3 质粒标准品pMD-F57的标准曲线Fig.3 Standard curve of standard plasmid pMD-F57

2.4 实时荧光定量PCR的敏感性检测 对不同梯度浓度的pMD-F57质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，本试验所建立的荧光定量PCR方法最低可以检测到10个分子拷贝，而常规PCR方法在103拷贝/μL时能勉强观察到目的条带(图4)。表明本试验所建立的实时荧光定量PCR方法的敏感性比普通PCR高出约100倍。

图4 常规PCR检测副结核分枝杆菌的敏感性Fig.4 The sensibility of routine PCR detecting Mycobactium paratuberculosisM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准；1：1.0×108拷贝/μL；2：1.0×107拷贝/μL；3：1.0×106拷贝/μL；4：1.0×105拷贝/μL；5：1.0×104拷贝/μL；6：1.0×103拷贝/μL；7：1.0×102拷贝/μL；8：1.0×101拷贝/μL；9：空白对照M:DL-2 000 DNA marker;1:1.0×108 copies/μL;2:1.0×107 copies/μL;3:1.0×106 copies/μL;4:1.0×105 copies/μL;5:1.0×104 copies/μL;6:1.0×103 copies/μL;7:1.0×102 copies/μL;8:1.0×101 copies/μL;9:Blank control

2.5 实时荧光定量PCR的特异性检测 用所建立的实时荧光定量PCR方法对副结核分枝杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌等常见微生物DNA样品进行检测，检测结果均无扩增信号，而质粒标准品有良好的扩增，表明该方法具有良好的特异性。

2.6 实时荧光定量PCR的重复性检测 采用本试验所建立的实时荧光定量PCR方法，对3份阳性样品分别进行3孔重复检测，比较Ct值并计算组内变异系数；同时，将3份阳性样品分别进行3次检测试验，比较Ct值并计算组间变异系数。结果表明(表1)，本试验所建立的荧光定量PCR方法的组内变异系数低于0.31%，组间变异系数低于0.79%，该方法具有良好的重复性。

表1 荧光定量PCR检测的重复性试验Table 1 The reproducibility test of the established real-time PCR

2.7 副结核分枝杆菌荧光定量PCR与普通PCR方法的比较 分别采用本试验建立的荧光定量PCR方法与普通PCR方法对随机选取的50份牛粪便样本进行检测。结果表明，荧光定量PCR和普通PCR分别检出5份和4份阳性，阳性结果符合率为80%，表明本试验建立的荧光定量PCR方法具有较高可信度。

2.8 副结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的应用 采用本试验建立的荧光定量PCR方法对临床样品进行副结核分枝杆菌感染情况调查。从对新疆维吾尔自治区8个奶牛养殖场收集的85份粪便样品和116份牛乳样品进行实时荧光定量PCR检测(表2)。检测结果表明，本地区奶牛养殖场存在一定程度的副结核分枝杆菌感染，需引起相关部门的足够重视。

表2 动物临床样品副结核分枝杆菌感染检测Table 2 Detection of Mycobactium paratuberculosis infection in animal clinical samples

3 讨论

牛副结核病主要表现为顽固性腹泻、进行性消瘦，甚至死亡，该病不仅给我国畜牧业生产带来了巨大经济损失，更严重威胁着公共卫生安全。目前，治疗副结核病尚无特效的药物与方法，及时发现并淘汰感染牛群是根除此病的有效方法。副结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，具有较强的环境抵抗力。感染副结核后的牛往往具有一个较长的亚临床期，后期才表现出明显的临床症状。副结核分枝杆菌的分离培养条件要求苛刻，操作难度较高。因此，建立一种简单、高效、快速而又实用的副结核病检测方法，对该病的诊断，尤其是早期诊断具有重要意义。

近年来，荧光定量PCR方法被广泛应用于病原微生物的快速诊断及定量检测过程中。与常规PCR相比，荧光定量PCR具有灵敏度高、实时监测、准确定量的优势。荧光定量PCR所扩增的基因片段必需要有适宜的长度和良好的特异性，因此，引物的设计至关重要。目前，国内外已有多项建立副结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的报道，大部分方法以IS900序列作为检测的靶基因[8-9]。IS900序列在副结核分枝杆菌基因组中以多拷贝形式存在，因此将其作为检测靶基因可以大大提高检测的敏感性。然而，近年来越来越多的研究表明，某些非结核分枝杆菌中同样存在IS900序列，两者之间同源性极高[10]。这提示当以IS900作为靶基因进行荧光定量PCR检测时，应谨慎地解释检测结果。F57基因是副结核分枝杆菌独有的单拷贝基因，该基因在不同种属的副结核分枝杆菌中具有显著不同，可有效区分结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌及其他禽分枝杆菌[11]。

本试验所建立的针对F57基因的荧光定量PCR检测方法能特异鉴定副结核分枝杆菌，与结核分枝杆菌及其他常见病原微生物无交叉反应，具有良好的特异性；该方法最低能检测到10个拷贝，具有较高的灵敏性。此外，将本试验所建立的荧光定量PCR方法与普通PCR方法结果进行了比较，结果表明，该方法具有较高的可信度和灵敏度。整个荧光定量PCR操作仅需约1 h，检测全程在1个工作日内可以完成，适合应用于快速检测诊断，具有较高应用价值。

目前，国内关于牛副结核病的研究逐渐得到重视，已有多项关于牛副结核病的流行病学调查的研究报道。蔺晓月报道山东省部分规模化牛场的牛副结核血清抗体平均阳性率为4.61%[12]。高海慧等对宁夏奶牛养殖区的9个奶牛养殖场采集1 796份血清样本，检测结果显示，各场阳性率在1.78%～15.15%，样品血清平均阳性率为4.29%[13]。

为了解新疆地区规模化牛场的副结核病感染情况，本试验从新疆地区8个奶牛养殖场中，收集了85份粪便样品和116份牛乳样品，使用本试验建立的荧光定量PCR方法对临床样品进行副结核分枝杆菌感染情况调查。检测结果显示，新疆地区规模化牛场粪便阳性率为9.41%，奶样阳性率为5.17%，粪便样本的病原检出率略高于奶样。流行病学调查显示，新疆地区规模化奶牛养殖场存在一定程度的副结核分枝杆菌感染，有关部门应当采取有效措施，控制牛副结核病的流行。