链球菌毒性噬菌体的分离与生物学特性研究

徐凤宇，邱子怡，孙 亮，马红霞，高云航，么乃全

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118)

链球菌分布广泛，有些可致人或动物败血症、乳腺炎、肺炎、化脓性疾病及脑脓肿等[1]。随着抗生素广泛应用，链球菌对抗生素的耐药性逐渐增强，关琳等[2]报道15株猪链球菌9型对大环内酯类及林可胺类耐药率为100%，对四环素及链霉素耐药率为93.3%，所有菌株达七重耐药。主动外排机制和靶位修饰、核糖体保护蛋白、钝化或灭活抗生素、产生生物被膜等是链球菌耐药的原因[3]；猪链球菌对杆菌肽的抗性与包含SstF、SstE、SstG的ABC 转运系统有关[4]。为防治链球菌病，研究者不懈开发新生物防治剂，内溶素、噬菌体及其裂解酶[5-6]等成为研究目标。

除直接防治链球菌病外，噬菌体在链球菌群体形成、遗传变异、致病性、抗生素抗性等方面也扮演重要角色[7]；研究噬菌体可帮助了解细菌生态学和进化，如含噬菌体SMP的溶原性猪链球菌SS2-4(SMP)毒力明显强于野生株、生长更快、菌链变短[8]；噬菌体也被添加于选择培养基，抑制杂菌生长，降低分离培养假阴性率[9]。本研究以分离自牛子宫内膜炎的致病性链球菌为宿主，分离链球菌毒性噬菌体，研究其主要生物学特性，为更深入研究和应用链球菌噬菌体提供资料。

1 材料与方法

1.1 菌株 宿主菌链球菌48株，由本实验室分离自患子宫内膜炎的奶牛子宫；指示菌S-1株、S-2株、S-3株、S-4株、S-5株、S-6株、S-7株、S-8株、S-9株、S-10株链球菌，由本实验室分离鉴定并保存。

1.2 主要试剂与仪器 DNaseI、RNaseA，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；限制性内切酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；TSA、TSB培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；上层TSB培养基(含0.75%琼脂)、下层TSA培养基、2×TSB培养液按说明书配制；SM液按《分子克隆实验指南》(第3版)[10]附录1配制。Himac CP100MX超速离心机由日立公司生产；TEM-100CX透射电镜由TEOLLTD公司生产。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌的准备 取冻存的宿主菌在TSA平板上划线培养，次日取单菌落于5 mL TSB培养基中，37 ℃、150 r/min 振摇培养。

1.3.2 噬菌体的分离、纯化 以链球菌悬液为宿主，用2×TSB作浓缩培养基，以从长春市某处新采集的污水为样品，参考文献[11]中材料与方法3，37 ℃ 分离噬菌体，重复增殖5次，12 000 r/min离心15 min，细菌滤器过滤得拟含链球菌噬菌体的原液。

点滴法验证：将100 μL过夜培养的链球菌(浓度约1.0×106CFU/mL)于TSA平板上涂匀，静置20 min，滴加噬菌体原液5 μL，阴性对照组滴加等量生理盐水，37 ℃培养12 h后观察。

双层平板法纯化噬菌体：参考文献[11]中材料与方法5进行，略有改动。

1.3.3 噬菌体的电镜观察 取适当稀释噬菌体，经双层平板培养成噬菌斑网，加入3 mL SM液，4 ℃冰箱中振荡10 h，吸出噬菌体液，12 000 r/min离心20 min，取上清30 μL滴于铜网上，静置30 s，2%磷钨酸负染90 s，晾干，透射电镜观察。

1.3.4 噬菌体基因组酶切分析 参考文献[10]中从大规模培养物提取λ噬菌体基因组方法得噬菌体核酸，分别用BlnⅠ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、NcoI和Xhol I将核酸在适宜温度下酶切10 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。

1.3.5 噬菌体效价测定及裂解谱分析 用TSB培养基将噬菌体原液10倍梯度稀释，将100 μL宿主菌液、氯化钙和100 μL适当稀释的噬菌体混匀，静置，移入50 ℃保温的半固体培养基，铺双层平板，37 ℃培养12 h，记噬菌斑数。噬菌体效价(PFU/mL)=平均噬菌斑数×稀释倍数×10。

点滴法分析噬菌体裂解谱：将10株指示菌(106CFU/mL)各100 μL分别均匀涂于TSA培养基表面，室温静置30 min后，滴加5 μL纯化噬菌体液，吸收5 min，37 ℃培养过夜，观察细菌、噬菌体生长情况。

1.3.6 氯仿、乙醚敏感性测定 (1)氯仿敏感性测定：将50 μL氯仿与950 μL噬菌体液(6.2×108PFU/mL)混匀，对照组不加氯仿，4 ℃冰箱孵育过夜，测噬菌体效价。(2)乙醚敏感性测定：将200 μL 乙醚与800 μL噬菌体液(6.2×108PFU/mL)混匀，对照组不加乙醚，冰浴振荡1 h，3 000 r/min离心15 min，测噬菌体效价。

1.3.7 噬菌体的热稳定性与酸碱稳定性测定 设8个不同水浴温度，在每个温度下放1支装有1 mL新扩增噬菌体液的1.5 mL EP管，分别作用20、40 min 和60 min，取出冷却至室温，测效价。

用1.5 mL灭菌EP管分装900 μL pH 2～13的TSB培养基，37 ℃水浴预热30 min，在各离心管中分别加入100 μL噬菌体液，混匀，继续放置3 h，取出置室温下测效价。

1.3.8 最佳感染复数测定 取对数期宿主菌，适当稀释噬菌体和宿主菌悬液，按表1加入等量噬菌体和宿主菌，37 ℃ 50 r/min振荡培养5 h，4 ℃下12 000 r/min 离心30 min，取上清液，用双层平板测各组效价，筛选最佳感染复数(Multiplicity of infection，MOI)。

1.3.9 一步生长曲线绘制 按最佳MOI将宿主菌与噬菌体混匀，37 ℃水浴中孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min 离心60 s，弃上清，用TSB洗涤沉淀2次，加入37 ℃预热TSB培养基，37 ℃ 50 r/min振摇培养，每隔10 min取500 μL培养物，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清测噬菌体效价。以效价对数为纵坐标，以感染时间为横坐标绘制一步生长曲线。

2 结果

2.1 噬菌体分离纯化 富集5次后，点滴法验证结果表明，链球菌48株生长的TSA平板上滴加噬菌体原液处呈明显噬菌现象，对照处菌苔正常，说明原液中含链球菌毒性噬菌体。经反复纯化，得空斑一致、清晰透亮、边缘整齐的纯化噬菌体(培养12 h)，命名为SP48。

2.2 噬菌体电镜观察 透射电镜观察到SP48呈蝌蚪状复合对称，头部大小(79.0±0.33)nm×(73.0±0.38)nm，尾长(354±0.25)nm，属于长尾噬菌体科(图1)。

图1 噬菌体SP48电镜图Fig.1 Electron micrograph of phage SP48

2.3 噬菌体基因组酶切分析 分别用BlnⅠ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、NcoⅠ、XholⅠ酶切，电泳发现，SP48含有EcoR Ⅰ、XholⅠ和BlnⅠ的酶切位点，表明噬菌体SP48核酸为双链DNA。经EcoR Ⅰ酶切可见7个条带，经XholⅠ酶切可见5个条带，经BlnI酶切可见3个条带(图2)，与Marker比对、计算可知噬菌体SP48的基因组大于60 kb。

图2 噬菌体SP48基因组酶切电泳图Fig.2 Enzyme digestion of phage SP48 genomeM：DL-15 000 marker；1：EcoR Ⅰ的酶切产物；2：BamH I的酶切产物；3：XholⅠ的酶切产物；4：BlnⅠ的酶切产物；5：NcoⅠ的酶切产物M：DL-15 000 marker；1：Products of EcoR Ⅰ digestion；2：Products of BamH I digestion；3：Products of XholⅠ digestion；4：Products of Bln Ⅰ digestion；5：Products of Nco Ⅰ digestion

2.4 噬菌体的效价测定及裂解谱分析 经双层平板法测得噬菌体SP48的效价为6.2×108PFU/mL。点滴法测定SP48的宿主谱，发现其仅裂解宿主菌链球菌48株，说明其特异性很强。

2.5 氯仿、乙醚敏感性试验 乙醚、氯仿分别与噬菌体SP48作用后，测得效价分别为5.8×108PFU/mL和4.3×108PFU/mL，说明噬菌体SP48对乙醚和氯仿不敏感，推测其无囊膜。

2.6 噬菌体的热稳定性与酸碱稳定性 SP48的热稳定性结果见中插彩版图3，在40～45 ℃作用60 min 后的效价低于作用20 min和40 min的效价；50 ℃以下作用时间短于40 min时，对噬菌体感染性几乎无影响；高于50 ℃作用60 min时，噬菌体效价明显降低；60 ℃作用20 min噬菌体SP48完全失活。

图3 噬菌体SP48的热稳定性Fig.3 Thermal stability of phage SP48

噬菌体SP48在pH 5～10的条件下效价变化不大(图4)，在强酸或强碱环境下(pH≤4或≥12时)失活。

图4 噬菌体SP48的pH稳定性Fig.4 Stability of phage SP48 in different pH conditions

2.7 噬菌体的最佳MOI测定 当MOI为10时，噬菌体SP48的效价为2.6×109PFU/mL，在7个MOI中最高，为最佳MOI(表1)。

表1 噬菌体SP48最佳感染复数测定结果Table 1 Determination results of optimal multiplicity of infection of phage SP48

2.8 噬菌体的一步生长曲线 绘制噬菌体SP48的一步生长曲线(图5)，发现SP48感染宿主菌后30 min 内，噬菌体的效价变化不明显，此时处于潜伏期；在感染后的30～110 min，噬菌体效价逐渐升高，为爆发期；随后的40 min，噬菌体效价稳定；根据公式爆发量=爆发结束时噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度，得SP48爆发量约45 PFU/cell。

图5 噬菌体SP48的一步生长曲线Fig.5 One-step growth curve of phage SP48

3 讨论

已报道的链球菌噬菌体基因组均为dsDNA，大多属长尾病毒科，一些属短尾病毒科，罕见肌尾病毒科成员[12]。Harhala等[13]分离到2株化脓链球菌溶原性噬菌体Str01和Str03，尾长分别为186 nm、162 nm，基因组分别为37 030 bp和32 296 bp；柏琴琴等[14]以无乳链球菌为宿主从乳腺炎奶样中分离出LYGO9、HZ04，从牛源无乳链球菌中诱导出溶原性噬菌体pA11，与该实验室前期分离的JX01均为长尾噬菌体，推算4株噬菌体的基因组约38～45 kb。本研究从污水中分离到的链球菌噬菌体SP48也属长尾噬菌体，基因组较前述链球菌噬菌体更大，尾更长。

关于链球菌噬菌体对环境抵抗力，Luo等[15]分离的无乳链球菌长尾噬菌体HN4对60～80 ℃和pH 3～5敏感；Harhala等[13]报道Str01、Str03在40 ℃下作用60 min 的存活率(88%、96%)低于作用15 min 的存活率(98%、100%)，在60 ℃下作用15 min 可保持15%、23%的存活率，作用60 min全被灭活；本研究分离到的SP48在40～60 ℃时随作用时间延长和温度升高，存活率也降低。Str01、Str03在pH=7时最稳定，1 h存活率为92%、99%，5 h 存活率为83%、90%，在pH≤4或≥12环境下存活不超过1 h[13]；SP48在pH≤4或≥12时存活3 h以下。无乳链球菌噬菌体LYGO9的潜伏期仅5 min，爆发期25 min，平均爆发量30 PFU/细胞[14]；SP48较LYGO9的潜伏期、爆发期长，爆发量约为LYGO9的1.5倍，二者的杀菌能力有待试验确定。

噬菌体有一定裂解谱，能跨种裂解的噬菌体较少，也是用噬菌体用于细菌性疾病治疗的优势之一。链球菌噬菌体的裂解谱可能与宿主分型有关，Str01、Str03对37株A群链球菌的裂解率分别为13.5%、51%，对34株B群链球菌的裂解率分别为3%和0[13]；噬菌体LYGO9、HZ04、pA11、JX01可裂解的链球菌荚膜多糖分型以Ⅰa居多，但并非所有Ⅰa型无乳链球菌均被裂解，8株荚膜多糖Ⅱ型菌均不被裂解[14]。查涛等[16]发现，噬菌体phiYe-F10对O∶3小肠结肠炎耶尔森菌的裂解率为84.5%，不裂解O∶5、O∶9血清型和其他菌株，而O抗原位于细胞壁脂多糖(LPS)外侧，推测与噬菌体phiYe-F10的受体相关。本研究获得的噬菌体SP48仅裂解宿主链球菌，不裂解10株指示菌，推测可能的原因为指示菌与宿主48株链球菌非同种或者非同型。