气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定富勒烯中痕量苯残留

钱 冲 胡光辉,2 勾新磊 刘伟丽,2 高 峡,2 张 梅,2*

(1. 北京市理化分析测试中心，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室北京 100089；2.北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089)

作为碳的一种同素异形体，富勒烯是由五边形和六边形组成的笼状结构全碳分子[1]。C60、C70富勒烯是最为常见的种类，也是理化性质最稳定、研究最为广泛的两种富勒烯。其中，C60是最小的遵守独立五元环规则的富勒烯，具有类似足球一样完美对称的结构，其合成产率也最高[2]。大量的研究发现，富勒烯材料在超导、磁性、光学、催化、生物等方面表现出优异的性能，并已在生物医药、新能源、新材料等领域得到越来越广泛的应用[3-7]。特别是富勒烯分子独特的π电子结构以及低电子重组能、高电子迁移率等，使其成为医学诊断及治疗等生物医学领域重要的功能原材料。

经过三十余年的发展，富勒烯的合成方法日益完善，包括火焰燃烧法、电弧放电法、石墨电阻蒸发法、激光蒸发法等[8, 9]，各种方法的工艺条件不一样，产量和纯度等也不尽相同。绝大多数方法合成的初产物为C60、C70等多种富勒烯与其副产物的碳灰混合物，成分非常复杂，由于不同富勒烯彼此间的分子结构、理化性质十分相似，如何对富勒烯的碳灰产物进行高效提取和分离是影响富勒烯发展的重要技术挑战。只有将合成的富勒烯进行有效提取和分离，才能进一步对其独特的结构和性质进行深入研究，为进一步拓展富勒烯的应用提供基础[10-12]。

在富勒烯的分离、提取及改性研究中，芳香苯类化合物是最为常用的有机溶剂，特别是苯作为芳香族有机溶剂的典型代表被广泛使用。由于苯环的结构与富勒烯较为相似，苯在富勒烯的分离提取过程中难以被完全去除，这导致其在最终的富勒烯产品中不可避免地残留。然而，作为一类致癌物，苯的毒性较大，会对人体的呼吸系统、神经系统、血液系统造成损害，并影响人体的造血和免疫机能，严重威胁人类生命健康[13]。因此，对富勒烯中苯残留进行有效分析与监测是保障产品安全性能的必要手段，对推动富勒烯在更多领域的应用具有重要意义。

目前，关于苯残留检测的相关研究主要集中在化工、环境、食品等领域[14-16]，而关于富勒烯中苯残留的分析方法还鲜有文献报道。气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)是苯残留检测最常用的方法[17,18]，这两种方法的缺点在于灵敏度较低、受基质干扰影响大，易出现假阳性结果。相比而言，气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-MS/MS)通过二次打碎母离子，生成特异性更强的子离子，能够在很大程度上提高检测方法的灵敏度、降低基质干扰，有效避免假阳性结果的出现[19,20]，这也为富勒烯中苯残留的分析提供了可能。本研究选取灵敏度高且基质效应小的GC-MS/MS法，建立了测定C60、C70富勒烯中痕量苯残留的分析方法，并开展了相关方法学验证实验。研究结果将为富勒烯中其它溶剂残留的检测技术提供借鉴，为富勒烯的应用特别是药物临床前的质量评价提供重要技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(GCMS-TQ8040)，GCMSsolution 4.30工作站，日本Shimadzu公司；涡旋混合器(Vortex-genie 2)，美国Scientific Industries公司；超声清洗器(KQ-300DE)，中国昆山舒美公司；电子天平(XPE105)，瑞士Mettler Toledo公司；甲醇(色谱纯)，美国Thermo Fisher Scientific公司；苯标准品溶液(1000 μg/mL)，美国Accustandard公司；C60富勒烯(批号：SES60F2018020203)、C70富勒烯(批号：SES70F2017073104)，由中科院化学所提供，用于方法学验证；其它C60、C70富勒烯样品均购自市场。

1.2 标准溶液配制

取浓度为1000 μg/mL苯标准品溶液适量，用甲醇将其逐级稀释至浓度分别为3.00、10.00、20.00、40.00、200.00、400.00 μg/L的标准溶液，现用现配。

1.3 仪器工作条件

GC条件：DB-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250℃；载气为He。进样量1.0 μL，分流比5:1，柱流量1.0 mL/min。升温程序：初始柱温在50 ℃保持1 min，经20 ℃/min升至100 ℃，之后30 ℃/min升至280 ℃并保持2 min。

MS/MS条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃，溶剂延迟时间0.5 min，采用多重反应监测模式(MRM)。保留时间和MRM条件参数见表1所示。

表1 苯保留时间及MRM条件参数

1.4 样品处理

称取C60、C70富勒烯样品100 mg置于2 mL离心管中，加甲醇1 mL，涡旋震荡混匀后，置于超声清洗器中超声提取40 min并摇匀，经0.22 μm滤膜过滤。取滤液作为供试品溶液，按照仪器工作条件对其进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

图1为苯和甲醇的标准质谱图。苯的一级特征碎片离子(母离子)质荷比较小，因此提取溶剂的选择应具备以下条件：首先能够与苯互溶，苯在其中应有良好溶解度，以保证富勒烯中痕量苯残留可以被提取完全；其次分子量不宜过大，若提取溶剂的分子量太大，其母离子及相应的子离子会干扰苯的测定。

图1 苯(a)和甲醇(b)标准质谱图

甲醇是常用的分子量最小的有机提取溶剂，并且与苯有良好互溶性，其最大母离子的质荷比为32 m/z，很难再二次打碎生成相应子离子，不会对苯的检测造成干扰。因此，实验选择甲醇作为提取溶剂。

2.2 色谱及质谱条件的选择

为缩短检测周期，本实验仅在初始柱温50 ℃下保持了1 min，便以20 ℃/min的速度升值100 ℃。当柱温达到该温度时，苯已出峰完全，此时继续提高升温速率，以30 ℃/min的快速升值280 ℃，并在该温度下保持了2 min。这不仅减少了程序升温的时间、提高了检测效率，同时还达到了老化色谱柱的效果。

实验选择苯的质核比较大的一级特征碎片离子78和77 m/z作为母离子，进行碰撞能优化，并选择丰度较高、质核比较大的子离子进行定性与定量分析。如表1所示，实验选择78.00>52.10 m/z作为定量分析离子对，选择77.00>51.10 m/z和78.00>39.10 m/z作为定性分析离子对。

2.3 方法专属性

针对方法的专属性进行考察，按照试验方法分别对甲醇空白溶剂、苯标准溶液(200 μg/L)、C60富勒烯供试品溶液(100 mg/mL)、C70富勒烯供试品溶液(100 mg/mL)进行检测分析。

如图2和图3所示，实验结果表明苯的色谱峰型及响应性均良好，甲醇、样品中其它成分未对苯的检测造成干扰。这表明本分析方法具有良好的专属性，可以满足C60、C70富勒烯中痕量苯残留的检测要求。

图2 甲醇空白溶剂(a)和苯标准溶液(b)选择离子流图

图3 C60(a)和C70(b)富勒烯供试品溶液选择离子流图

2.4 检出限、定量限和线性范围

按照试验方法对标准溶液系列进行测定，分别以苯定量离子对78.00>52.10 m/z峰面积(y)和对应的浓度(x，μg/L)进行线性回归计算，得到线性回归方程和线性相关系数。分别以10倍信噪比(S/N>10)和3倍信噪比(S/N>3)计算出仪器的的定量限和检出限，再按1.4样品的处理方式换算出苯的方法定量限与方法检出限。

分析结果如表2和图4所示，苯在3～400 μg/L浓度范围内表现出良好的线性关系，线性相关系数(r2)为0.9999，方法检出限和定量限分别为9.00 μg/kg、30.00 μg/kg。

表2 苯的线性方程、相关系数、检出限和定量限

图4 苯的标准曲线

2.5 超声提取时间的选择

分别称取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL离心管中，加入甲醇1 mL，涡旋震荡混匀。分别平行制备7份，置于超声清洗器中，分别超声提取0、5、10、20、40、60、90 min后摇匀，并经0.22 μm滤膜过滤，取滤液进行检测分析。

表3为C60、C70富勒烯分别经不同超声时间提取后苯含量的检测结果。实验结果表明，C60富勒烯超声时间小于10 min时未检出苯；超声时间为20 min时，苯含量为6.58 μg/kg，小于方法检出限9.00 μg/kg；超声时间为40min时，苯含量为48.31 μg/kg；当超声时间大于40 min时，苯的检测结果趋于稳定。

表3 超声提取时间优化结果 苯含量，μg/kg

对于C70富勒烯，当其超声时间小于40 min时，随着超声时间的延长，苯的检测结果呈逐渐增加趋势；当超声提取时间大于40 min时，苯的检测结果也趋于稳定。因此，本方法优选的C60、C70富勒烯的超声提取时间为40min。

2.6 系统适应性

实验配制浓度200.00 μg/L的苯标准溶液，连续测定6次，以苯定量离子对78.00>52.10 m/z峰面积的RSD%值来考察方法的系统适应性。实验结果见表4所示，苯标准溶液连续六次测得峰面积的RSD%值为0.95%，表明方法具有良好的系统适应性。

表4 系统适应性试验结果(n=6)

2.7 重复性和中间精密度

实验配制C60、C70富勒烯供试品溶液，分别平行配制6份，并按照试验方法进行检测分析，重复性试验结果如表5所示。C60、C70富勒烯6次检测结果的平均值分别为48.34 μg/kg和750.04 μg/kg，对应的RSD%值分别为4.81%、1.35%。

表5 重复性试验结果(n=6)

此外，实验进一步考察了不同时间、不同实验人员在同一台仪器上的数据重复性，通过重复上述试验步骤，并以苯6次检测结果与重复性项进行比较。以苯12次测得含量的RSD%值考察方法的中间精密度，结果见表6所示。C60、C70富勒烯中苯残留的12次检测结果的平均值分别为48.28 μg/kg和750.26 μg/kg，对应的RSD%值分别为4.48%、1.25%。

表6 中间精密度试验结果(n=12)

2.8 加标回收率

实验配制苯浓度分别为160.00、200.00、240.00 μg/L的标准溶液，分别称取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL离心管中。分别加上述配制的标准溶液1 mL，涡旋震荡混匀后，超声提取40分钟并摇匀，经0.22 μm滤膜过滤。取滤液作为加标回收样品溶液，配制成加标浓度分别为1600.00、2000.00、2400.00 μg/kg的低、中、高浓度的加标回收样品溶液，每个加标浓度平行配制6份进行检测分析。

以2.7小节重复性项中C60、C70富勒烯苯残留检测结果的平均值(分别为48.34 μg/kg和750.04 μg/kg)作为本底值，再根据标准曲线实际测得加标回收样品的结果与理论添加量的比，计算加标回收率和RSD%值。实验结果见表7所示，苯不同浓度加标回收率在94.39%～96.45%之间，对应的RSD%值在1.15%～1.41%之间。

表7 加标回收率试验结果(n=6)

2.9 样品分析

从市场采购了3种C60富勒烯和2种C70富勒烯样品，按照本试验方法对其中的苯残留量进行分析测定。检测结果如表8所示，市售的C60、C70样品中均未检测出苯，苯残留量均低于方法检出限9.00 μg/kg。

表8 市售C60、C70富勒烯样品的检测结果

3 结论

C60和C70富勒烯理化性质稳定、产率高，被广泛应用于化工、生物医学、化妆品等众多领域。目前，药物分析中对苯的残留量有明确的限量规定，关于富勒烯作为最有潜力的药物材料之一，其中苯残留的分析方法尚鲜有报道，亟需明确并建立C60、C70富勒烯中苯残留的分析测试方法。本工作探索并建立了基于GC-MS/MS测定C60、C70富勒烯中痕量苯残留的方法，并系统开展了相关方法学验证。研究结果表明，该方法的选择性好、灵敏度高、分析速度快，并且操作便捷、检测成本低，可广泛应用于C60、C70富勒烯样品中痕量苯残留的定量及定性检测。研究结果将有助于指导富勒烯中其它残留组分的测定，对富勒烯的应用推广特别是药物临床前的质量评价具有重要意义