高效液相色谱-串联质谱法检测清肺止咳散中添加阿奇霉素含量

章安源，张传津，王洪涛，张 琦，陈志强，李有志，魏秀丽，牛华星，杨修镇，薄永恒，刘霄飞，魏茂莲，田学磊，陈 玲 *

(1.山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022；2.潍坊海关，山东潍坊 261041；3.青岛信诺邦生物科技有限公司，山东青岛 266000，)

大环内酯类抗生素阿奇霉素抗菌谱广，临床上广泛用于治疗敏感菌所致呼吸道、皮肤和软组织感染[1-3]。有些养殖户在化痰清肺、平喘止咳等中兽药散剂中违规添加阿奇霉素, 目的是控制畜禽咳喘病的治疗，我国农业部在2005年8月曾发布了第560号令,取消了阿奇霉素作为兽药使用。非法添加人用抗生素，不仅易产生细菌耐药性问题,而且增加动物源性食品中阿奇霉素的残留风险。当前国内外尚无中兽药散剂中阿奇霉素的检测方法标准，仅有含量测定相关的液相色谱方法，专属性不强，且中药组分的干扰较大，本实验拟建立高效液相色谱-串联质谱方法检测中兽药散剂中违规添加的阿奇霉素含量，为中兽药单方或复方制剂中非法添加阿奇霉素含量的定性、定量检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器 AE-240电子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)； Agilent 1260-6460高效相色谱四极杆电离喷雾串联质谱仪(美国安捷伦公司)； KQ-250DB超声仪(昆山市超声仪有限公司),5810R高速冷冻离心机(日本日立公司)，0.22 μm的滤膜为美国Waters 公司。

1.2 药品及试剂 阿奇霉素(来源：CAS公司，编号：83905-01-5，纯度≥97%)。甲酸、乙腈(色谱纯，德国Merk公司，)；超纯水。高纯氮，高纯氩(纯度均为99.99%，济南德阳气体有限公司。

1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，100 mm×3.0 mm，粒径2.7 μm，或性能相当者；流动相A：乙腈；流动相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。高效液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Program of gradient elution

1.4 质谱条件 电离方式：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9.0 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11.0 L/min；碰撞气：40 psi；毛细管电压：4 kV；测试药物定性、定量离子和碰撞能量见表2。

表2 质谱测定参数Tab 2 Mass Spectrometric Determination of Parameter

1.5 样品制备

1.5.1 阴性样品 清肺止咳散，来源：山东某兽药企业；批号20201101。

1.5.2 标准储备液的制备 精密称取阿奇霉素标准品10.31 mg(准确至0.01 mg)，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀, 即得1000 μg /mL标准储备液。-20 ℃冰箱保存，贮存期3个月。

1.5.3 样品溶液的制备 准确称取1.5.1项下样品0.2 g(精确到0.001 g)于250 mL三角烧瓶中，加入50 mL 40%乙腈溶液超声提取15 min，转移至100 mL容量瓶中，加初始流动相(1.3)稀释至刻度。用滤纸过滤，收集续滤液。准确吸取续滤液1.0 mL，至10 mL容量瓶中，用初始流动相(1.3)稀释至刻度，摇匀，滤膜过滤，过滤液待测。同时按上述步骤做样品空白试验。

1.5.4 空白基质溶液的制备 称取0.2 g 样品50 份，按照1.5.3项下方法处理后即得空白基质溶液。

1.5.5 基质匹配标准储备溶液的制备 精密量取标准储备液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得10 μg /mL的基质匹配标准储备溶液。

1.5.6 阳性添加样品的制备 准确称取阿奇霉素5、10、20、50 mg加入到阴性空白散剂样品100 g中，混匀，即每1 kg分别添加阿奇霉素50、100、200、500 mg，每个添加量制备3份平行样，按待测样品制备方法(1.5.3项)制备阳性添加样品，在上述液相色谱条件(1.3项)和质谱条件(1.4项)进行测定，每份样品至少进样2次，取平均值。

1.5.7 基质标准曲线的制备 准确吸取5.0 mL基质匹配标准储备溶液(10 μg/mL)，至100 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，得500 ng/mL的基质标准溶液。分别吸取500 ng/mL的基质标准溶液适量，用空白基质溶液倍比稀释，得5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的标准物质系列工作液。

2 结果与分析

2.1 线性考察 在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可有效地分离各离子。5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的基质匹配标准溶液，经高效液相色谱-串联质谱仪测定后，以标准溶液中阿奇霉素定量离子峰面积为纵坐标，标准溶液中相应的阿奇霉素浓度为横坐标，绘制基质标准曲线。阿奇霉素在5～250 ng/mL范围内标准曲线线性回归方程为Y=1309.94X+119.96，其决定系数R2为0.9993，线性关系良好。

2.2 精密度试验 精密吸取基质匹配标准溶液50 ng/mL(10 μL)，连续进样6次。以峰面积计算，得出阿奇霉素峰面积的RSD(相对标准偏差)为1.8%。表明仪器精密度良好，符合检测要求。

2.3 稳定性试验

2.3.1 标准溶液稳定性 配制阿奇霉素标准储备液将其分装为3瓶，分别将其储存在冷冻、冷藏和室温条件下，每周稀释上机，考察稳定性。实验数据表明，-20 ℃和4 ℃储存的标准储备液3个月内无明显差异，25 ℃存储条件下略有差异。结果见表3。

表3 标准储备液稳定性考察Tab 3 Stability of standard stock solution

2.3.2 基质添加阿奇霉素稳定性 清肺止咳散中添加阿奇霉素(50 mg/kg)后，分别将其储存在冷冻、冷藏和室温条件下，稀释至10 ng/mL上机，并且每周将不同储存状态下的标准储备液和中间液进行稀释上机，即用第0天的数据为标曲单点对每周的数据进行校正。实验数据表明，在冷冻(-20 ℃)条件下储存的标准90 d内，无降解。而在室温条件下储存的阿奇霉素储备液从第2个月开始出现降解；阿奇霉素中间液从第1个月就开始出现降解，第2个月时已经出现明显降解。结合实验数据和GB/T 27404-2008推荐的有效期，阿奇霉素储备液和中间液的有效期最终定为3个月。结果见图1。

图1 清肺止咳散添加阿奇霉素溶液稳定性Fig 1 Stability of Qingfeizhike powder added azithromycin solution

2.4 回收率试验 50、100、200、500 mg/kg四个添加浓度下，平均回收率在89.1%～98.6%(表4)。批内相对标准偏差<1.6%，批间相对标准偏差为4.1%。

表4 回收率和精密度试验结果(n=3)Tab 4 Result of recovery and precision for azitromycin

2.5 检出限和定量限 空白基质按确定的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白基质对所测分析物无干扰。在空白样品中添加阿奇霉素标准品，按确定的提取方法处理后，经高效液相色谱-串联质谱仪检测，计算信噪比。添加浓度为25 mg/kg时，标准溶液信噪比(S/N))≥3，确定为方法的检出限。添加浓度为50 mg/kg时，标准溶液显示信噪比(S/N))≥10，作为此方法定量限。检测限和定量限满足检测要求。

2.6 质谱图 空白样品、对照溶液及阳性添加样品的高效液相色谱-串联质谱图见图2～图4。

图2 空白样品特征离子质量色谱图Fig 2 Extraction ion chromatograms of the blank sample

图3 对照溶液提取离子色谱图Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

图4 阳性添加样品特征离子质量色谱图Fig 4 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 讨论与结论

3.1 前处理方法的选择与优化 为确保散剂中添加阿奇霉素有效成分全部溶解，分别用甲醇、乙腈、水、20%乙腈水、40%乙腈水、60%乙腈水、80%乙腈水、乙腈：0.1%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.2%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.5%甲酸水(40∶60)对不同批号的样品稀释并超声提取。结果发现甲醇、水提取时，提取得到供试品杂质成分多，回收率不高；用乙腈提取后的提取液较为清澈，基质干扰小。因为阿奇霉素在中性水溶液中相对较稳定，因此，决定调节乙腈和水的比例，实验结果发现，40%乙腈水提取后的供试品溶液基质干扰最小。阿奇霉素属于弱碱性化合物，易溶于酸性水溶液[4]，为进一步确定甲酸水的用量，研究比较甲酸0.1%、0.2%、0.5%用量时，结果表明甲酸用量为0.1%时，超声提取15 min，且基质效益无明显差别，杂质干扰少，峰形对称，阿奇霉素回收率较高。故选择初始流动相处理样品。基质匹配标准溶液采用空白基质溶液定容，空白基质溶液在与阿奇霉素对照品相同保留时间处，均无色谱峰出现，证明在很大程度上基质效应小，实验准确度高。

3.2 液相色谱条件的选择与优化 本实验分别考察甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液分离情况，摒弃了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(12∶88)作为流动相，降低了色谱柱因磷酸盐易堵的风险[5-8]。不断调整流动相比例：甲醇和乙腈由30%下降到10%，最终选择了乙腈-0.1%甲酸水(1∶9，体积比)为初始流动相，不仅能使阿奇霉素很好的分离，其特征离子质量色谱图的峰形和分离度好，降低了检测成本，有机试剂使用量较少，有利环保。

3.3 质谱条件的选择与优化件的选择与优化 采用1.0 μg/mL的阿奇霉素标准溶液在不接色谱柱的条件下，分别用电喷雾电离正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)进行母离子全扫描。结果发现，阿奇霉素正离子模式的[M+H]+为m/z749.3，负离子模式下的[M-H]-为m/z747.3，[M+H]+信号远远高于[M-H]-。在正离子模式(ESI+)下对阿奇霉素进行二级质谱全扫描，得到m/z591.1、m/z158.3、m/z116.1、m/z83.1四个相对信号较高的子离子。利用安捷伦Optimizer软件对阿奇霉素的子离子碎裂电压、碰撞能量等参数进行进一步的优化，获得最佳的仪器条件。结合样品基质的质谱图最终选取离子丰度最高、本底干扰最小的m/z749.3>591.1作为定量离子，m/z749.3>158.3作为定性离子。

本实验建立了中兽药散剂中非法添加阿奇霉素含量的高效液相色谱-串联质谱法检测方法。实验过程简单、快速，回收率较高，各项性能指标均达到了行业标准要求，同时基质干扰小，检测结果准确可靠，检出限低，灵敏度高，适用于清肺止咳散中非法添加阿奇霉素的定性、定量检测，为治理整顿中兽药中添加违禁药物，提供了检测参考和技术支撑。