黄马通淋口服液质量标准研究

杨芬芳，吕继伟，赵乐凯，郝智慧

(中国农业大学动物医学院中兽医药创新中心，北京 100094)

犬泌尿道炎，中医称为“淋证”，是犬临床上常见和多发的疾病之一，在普通内科病中的发病率仅次于消化系统、呼吸系统疾病。此病四季均可发病，且在各种年龄、性别、品种中均有发现，年龄偏大的犬发病率较高[1]。淋证根据主症不同，常分为热淋、血淋、砂淋和膏淋等。证候不同，治法也会有差异，热淋治则为清热、利湿、通淋，血淋治则为清热、凉血、止血[2-3]。黄马通淋口服液的处方来源于中药成方制剂肾炎片[4]，是由一枝黄花、车前草、马鞭草、白茅根等六味药物配伍制成，本品具有清热解毒，利水通淋之功效[5-6]，主要用来治疗犬淋症。本方中一枝黄花清热解毒，疏散风热为主药；马鞭草清热解毒，活血通经，利水消肿[7-9]；白茅根清热利尿，凉血养阴[10-11]；车前草清热利湿，通淋排石[12]，葫芦壳利水消肿为辅药，协助主药一枝黄花清湿热，利水肿[13-14]；白前利气疏导，促进湿热排出为佐药[15]。配伍所得的黄马通淋口服液，具有清热解毒，利湿通淋的药效。因此，黄马通淋口服液在临床上对热淋和血淋有更明显的效果。

本制剂由肾炎片更改剂型而来，肾炎片质量标准非常简单，仅有一项黄酮类的颜色鉴别，无法区分单味药材，也没有有效成分的定量控制[4,16]，目前未见黄马通淋口服液完善的定性和定量控制方法。为了更加全面评价新制剂的质量，保证其疗效，本研究对黄马通淋口服液进行了一枝黄花的定性鉴别，对车前草中有效成分毛蕊花糖苷进行了定量测定，增加了该制剂可以定性定量质量控制标准。

1 材 料

1.1 试药 供试品黄马通淋口服液(批号20170701、20170702、20170703；20170801、20170802、20170803、20170804；20170901、20170903、20170905)由中国农业大学提供，由山东信得科技股份有限公司生产。毛蕊花糖苷，批号：111530-201713；一枝黄花对照药材，批号：121433-201304，由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 仪器 Agilent 1260色谱仪，DAD检测器；BT125D电子天平：赛多利斯；AL204分析天平：METTLER TOLEDO；DS-673分析天平：上海寺冈电子有限公司；KQ-5200DA超声仪：昆山市超声仪器有限公司；ZF-90型暗箱式紫外透射仪：上海顾村电光仪器厂。

1.3 试剂 G薄层预制板：青岛海洋化工厂；苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸：莱阳市康德化工有限公司(AR)；乙醇、磷酸：烟台三和化学试剂有限公司(AR)；乙腈：TEDIA公司(GR)；水为纯化水；其余所有试剂均为AR。

2 方法与结果

2.1 性状 参照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部“制剂通则”附录0110合剂部分及相关指导原则中制剂性状的研究规定，对10批本品进行外观形态、色泽特征目视观察，气味鼻闻口尝方法考察。10批本品结果见表1。根据十批本品的性状观察，不同批次产品的颜色会有差异，故综合工艺条件、放大效应、实际生产等因素，本品的性状为：棕色至棕褐色液体，气微，微苦。

表1 性状观察结果表Tab 1 Observation results of ten batches of samples

2.2 鉴别

2.2.1 颜色鉴别 取本品10 mL，蒸干，加水2 mL，研成糊状，加苯15 mL，研磨15 min分液取苯层，待挥干后，加入1 mL乙醇溶解，再加入盐酸3 mL，镁粉少许，即显橙黄色(图1)。

1：20170701批样品；2：20170702批样品；3：20170703批样品图1 黄马通淋口服液颜色鉴别图Fig 1 Color identification of HuangmaTonglin Oral liquid

2.2.2 一枝黄花的薄层定性鉴别 取本品5 mL，置于15 mL甲醇中，摇匀，滤过，滤液蒸干，溶解在15 mL水中，用15 mL乙酸乙酯分别提取2次，将乙酸乙酯液收集、合并、蒸干，所得物以2 mL甲醇溶解，即得。另取一枝黄花对照药材2.5 g，加入50 mL的水，煎煮2 h，滤过，将滤液浓缩至5 mL，从加入甲醇15 mL，同法制备。照薄层色谱法(附录0502)试验，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)为展开剂，吸取上述两种溶液各3 μL，分别在含4%磷酸氢二钠的硅胶G薄层板上点样，展开，取出，晾干，将薄层板置365 nm的紫外光灯下检视。供试品溶液与相对应的对照药材溶液相同位置显相同的斑点，阴性样品溶液对主斑点不干扰(图2)。

1：一枝黄花对照药材；2：20170701批样品；3：20170702批样品；4：20170703批样品；5：阴性样品图2 黄马通淋口服液TLC图Fig 2 TLC of Huangma Tonglin Oral liquid

2.3 检查

2.3.1 pH值 照《中华人民共和国兽药典》2015版二部(附录0631)pH值测定法，检测生产的10批黄马通淋口服液的pH值，见表2。十批样品检测结果显示，pH值在4.7～5.2，考虑到工艺条件、放大效应、实际生产等因素，暂定本品的pH值范围为4.0～5.5。

表2 pH值测定结果表Tab 2 Results of pH measurement

2.3.2 相对密度 取本品，照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部附录0601相对密度测定法项下的第1法比重瓶法项下的方法试验。10批黄马通淋口服液的相对密度结果见表3。检测结果显示，十批样品的相对密度为1.05～1.11，考虑到规模化生产可能带来的不确定因素等问题，暂定本品的相对密度不低于1.02。

表3 相对密度结果表Tab 3 Relative density results table

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 选用Agilent Zobax Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈-0.2%磷酸水溶液(20∶80)为流动相，检测波长为330 nm，流速为每分钟1.0 mL；柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

2.4.2 溶液的制备

2.4.2.1 对照品溶液的制备 用甲醇溶解适量的毛蕊花糖苷，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.4.2.2 供试品溶液的制备 取本品，摇匀，精密量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇摇匀，再加甲醇至刻度，用力摇匀，滤过，除去初滤液，取续滤液，即得。

2.4.2.3 缺失车前草阴性对照品溶液配制 按黄马通淋口服液处方比例及制备工艺制备缺车前草药材的口服液，摇匀后量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇摇匀，再加甲醇至刻度，用力摇匀，滤过，除去初滤液，取续滤液，即得。

2.4.3 专属性考察 对照品溶液、供试品溶液(批号20170701)和阴性样品溶液分别吸取各10 μL，进行检测。结果显示，毛蕊花糖苷峰与相邻峰可以达到较好的分离，分离度>1.5，阴性样品溶液在毛蕊花糖苷峰相应的位置上无干扰(图3)。

2.4.4 标准曲线制备 取毛蕊花糖苷对照品11.2 mg(含量以92.5%计)，将其置于50 mL容量瓶中，加60%甲醇摇匀使溶解，再加少量60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得标准品储备液。分别取适量储备液，用60%甲醇稀释成10.36、25.90、51.80、77.70、103.60、207.20 μg/mL的一系列浓度的对照品溶液，分别进样10 μL，于高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，测定各个浓度的峰面积。结果以浓度为横坐标(X，μg/mL)，峰面积值为纵坐标，进行回归计算，得标准曲线方程Y=13.108X+23.992(R2=0.9992)。如图4所示，毛蕊花糖苷在10.36～207.20 μg/mL之间存在着良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取20170701批供试品溶液10 (L，按2.2.1项下的色谱条件，重复检测6次，6次结果的RSD=0.61%，表明以该方法、该仪器测定毛蕊花糖苷时精密度良好。

2.4.6 重复性试验 取20170701批的样品，按2.2.2项下方法平行配制6份供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件，进行检测，6份样品的RSD=0.24%，表明该方法的重复性良好。

A．对照品；B．供试品；C．阴性样品A. Reference substance; B. The product; C. The negative samples图3 黄马通淋口服液HPLC图Fig 3 HPLC of Huangma Tonglin Oral liquid

图4 毛蕊花糖苷标准曲线Fig 4 Standard curve of Verbascoside

2.4.7 稳定性试验 配制20170701批号的供试品溶液，于0，2，4，6，8，12 h，分别精密吸取10 (L，按2.2.1项下的色谱条件，检测分析，几次结果间的RSD=0.80%，表明该样品溶液放置12 h相对稳定。

2.4.8 加样回收率试验 取本品(批号20170701，毛蕊花糖苷含量0.26 mg/ mL)2.5 mL，精密量取9份，分别置25 mL量瓶中，3份一组，共三组，备用，添加毛蕊花糖苷对照品，再按2.2.2项下配液，分别制成80%、100%、120%三个浓度水平的加样供试品溶液。精密吸取10 μL，按2.2.1项下色谱条件，检测分析，进行回收率的计算，见表4。

表4 加样回收率试验结果表Tab 4 Recovery test results of sample addition

2.4.9 样品测定 对10批黄马通淋口服液，进行测定，计算黄马通淋口服液中毛蕊花糖苷的含量，见表5。

表5 毛蕊花糖苷含量结果表Tab 5 Determination of Verbascosidecontent in the samples

3 讨论与结论

3.1 薄层色谱鉴别指标的选择 方中一枝黄花清热解毒，疏散风热为君药。《中华人民共和国兽药典》2015年版二部一枝黄花药材项下对一枝黄花药材的薄层色谱鉴别有成熟的方法，因此，首先选择对一枝黄花进行薄层色谱鉴别的研究。但是在研究的过程中发现，采用兽药典中规定的乙酸乙酷―甲醇―甲酸‐水(8∶1∶1∶1)为展开剂，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点不清晰，故需要进一步优化薄层色谱条件。

3.2 薄层色谱条件的优化 通过调整展开剂、薄层板、展开温度、点样量、预饱和时间等[17]能使薄层色谱达到较好地展开效果。结合参考文献[18,19]方法，更改展开剂比例进行考察，试验表明，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)为展开剂，供试品斑点清晰，阴性样品无干扰，分离度好。此鉴别方法操作简单，色谱特征斑点清晰，重现性良好，专属性强，可用来定性鉴别黄马通淋口服液中的一枝黄花。

3.3 含量测定指标的选择 该处方中一枝黄花、马鞭草、车前草3个药味在《中华人民共和国兽药典》2015年版二部的相应标准中均有的含量测定方法。前期也对3味药材分别进行了含量测定研究。但是在现有临床有效的水提工艺下，君药一枝黄花中芦丁的提取率较低，可能与芦丁的水溶性有关；对君药中的绿原酸也进行了研究，但是绿原酸易分解[20]；马鞭草在处方中用量相对较小，且其指标成分齐墩果酸和熊果酸水溶于水[21]；对车前草中毛蕊花糖苷和大车前苷进行研究，发现大车前苷提取率偏低，最终选择以毛蕊花糖苷作为含量测定指标。

3.4 含量测定条件的优化 液相色谱条件优化包括提取溶剂、流动相、柱温、流速等[22]。本研究考察了乙腈-0.1%甲酸溶液(17∶83)、乙腈-0.2%磷酸(20∶80)两种流动相，结果以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)为流动相，保留时间适宜，分离度好，因此选择以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)为流动相；二极管阵列检测器进行波长扫描，毛蕊花糖苷在330 nm附近有较大光谱吸收，选择以330 nm为检测波长。研究中比较了不同色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、InertSustain C18、Phenomenex Gemini C18；不同流速0.9 ml/min、1.0 ml/min、1.1 ml/min；不同柱温25 ℃、30 ℃、35 ℃等条件，样品中毛蕊花糖苷与其他峰均能达到基线分离。最终选定的色谱条件下，分离度高、峰型好，阴性无干扰，指标成分进样浓度与峰面积之间存在着良好的线性关系，准确度高，重现性好；对处方中毛蕊花糖苷的含量测定适用。

4 结 论

肾炎片做为临床用中药，疗效确切，中兽药通过“多成分、多作用、多靶点”在我国兽医医疗系统中发挥了重要作用[23]，因此，本研究在肾炎片质量标准的基础上，加强对以肾炎片为处方来源的黄马通淋口服液，进行了全面的质量评价。客观地进行了性状、pH值、相对密度、黄酮类颜色鉴别、一枝黄花薄层鉴别、毛蕊花糖苷含量测定的研究和规定，完善了鉴别项、增加了含量测定项，建立了较全面的质量标准，为控制黄马通淋口服液质量标准提供了较全面的依据。建立的一枝黄花的薄层鉴别方法方法操作简单、重现性良好、专属性强；建立的车前草药材中毛蕊花糖苷含量测定方法，方法简单、重现性好、准确度高，同时可用来控制黄马通淋口服液的质量，也为提高肾炎片的质量标准提供依据。